汪立群，Alan K.Chang，袁文杰，白鳳武

大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連 116024

過氧化物酶是氧化還原酶的一種，它的特點(diǎn)是可以利用過氧化氫氧化各種有機(jī)和無機(jī)化合物，在生物合成、降解和防御功能[1-4]等生命過程中發(fā)揮重要的作用。大多數(shù)過氧化物酶都是含有亞鐵血紅素的蛋白，在活性位點(diǎn)有一個(gè)鐵卟啉Ⅸ。最近，亞鐵血紅素蛋白中的DyP-type 過氧化物酶類在疾病診斷和木質(zhì)素等頑固廢棄物的降解方面都表現(xiàn)出很大的應(yīng)用潛能[5-9]，越來越受研究者所關(guān)注。

在1995年發(fā)現(xiàn)了一株具有染料脫色功能的擔(dān)子菌綱真菌水稻紋枯病菌 Thanatephorus cucmeris Dec 1，它能使18種不同類型的外源染料脫色[10]，隨后對(duì)該菌株中有染料脫色能力的酶進(jìn)行了純化，發(fā)現(xiàn)這種酶的底物特異性和傳統(tǒng)過氧化物酶不同，鑒定為含亞鐵血紅素的新過氧化物酶，稱為DyP[11]。研究者已從不同的真菌中純化出DyP-type 過氧化物酶[12-15]，晶體結(jié)構(gòu)研究表明其與以前描述的具有代表性的過氧化物酶是不同的。例如，傳統(tǒng)過氧化物酶主要是由α螺旋蛋白構(gòu)成，而缺乏β折疊，但DyP-type 過氧化物酶中β折疊如三明治一樣的結(jié)構(gòu)夾在α螺旋之間；另外，在亞鐵血紅素依賴的植物類型過氧化物酶中，為了亞鐵血紅素的定位，會(huì)有Fe-His-His 三個(gè)聯(lián)體保守氨基酸，而DyP-type 中是Fe-His-Asp 這樣的特定結(jié)構(gòu)[16-18]。在細(xì)菌中也發(fā)現(xiàn)了DyP-type 過氧化物酶，YcdB 是從E.coli中分離出來，研究最早也是最深入的DyP-type過氧化物酶之一[19]。目前，DyP-type 過氧化物酶基因已被克隆表達(dá)，并進(jìn)行了酶的分離純化及性質(zhì)研究[20-24]，已經(jīng)有超過80種推測的DyP-type過氧化物酶在 PeroxiBase database(http:peroxibase.isbsib.ch/)中注冊，超過400種同源蛋白可以通過PSI-Blast 檢測到。

運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌Zymomonas mobilis ZM4是一株重要的乙醇發(fā)酵細(xì)菌，以它高乙醇得率而受到研究者關(guān)注。那么除了它獨(dú)特的 Entner-Doudoroff 途徑外，是否自身可以產(chǎn)生某種酶保護(hù)細(xì)胞，防御及抵抗有毒物質(zhì)的損害？通過RHA1 DypB 的系統(tǒng)進(jìn)化分析，揭示Z.mobilis 中推斷的過氧化物酶與DypB 有高同源性[23]。利用生物信息學(xué)方法進(jìn)行分析，將Z.mobilis 中推斷的過氧化物酶與其他DyP-type 過氧化物酶進(jìn)行蛋白一級(jí)序列對(duì)比，它同樣具有DyP-type 過氧化物酶的一些典型特征。為了證明Z.mobilis 中確實(shí)存在DyP-type 過氧化物酶基因，將Z.mobilis中的推斷過氧化物酶基因首次通過序列分析并克隆到E.coli 中，繼而將重組蛋白進(jìn)行表達(dá)和純化，并研究其性質(zhì)，為這種新的DyP-type 過氧化物酶結(jié)構(gòu)功能和反應(yīng)機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

Z.mobilis ZM4(ATCC 31821)菌株、E.coli DH5α和BL21(DE3)/pLysS 為本實(shí)驗(yàn)室保存。引物合成及蛋白MALDI-TOF-MS 測定委托深圳華大基因(BGI)完成。DNA 序列測定由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。Pfu DNA 聚合酶、T4 DNA 連接酶和其他所有的限制性核酸內(nèi)切酶購自Fermentas 公司。DNA 基因組提取試劑盒、DNA 純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒與凝膠回收試劑盒均購自O(shè)MEGA 公司。DNA 和蛋白marker 購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。pET21b(+)質(zhì)粒購自Invitrogen 公司。瓊脂糖金屬螯合Ni 柱和PD-10脫鹽柱購自GE 公司。其他試劑及藥品均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

YMG 培養(yǎng)基(g/L)：無水葡萄糖4，麥芽提取物10，酵母浸粉4，121℃滅菌20 min，用于Z.mobilis 培養(yǎng)。

LB 培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母浸粉5，氯化鈉10，121℃滅菌20 min，用于E.coli 培養(yǎng)。

LB 選擇培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母浸5，氯化鈉10，121℃滅菌20 min，冷卻后加入Amp，使其終濃度為100μg/mL，用于E.coli 轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)。

對(duì)于固體培養(yǎng)基，在液體培養(yǎng)基中加入1.5%瓊脂粉。

2YT 培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨16，酵母浸粉10，氯化鈉5，121℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 pET21b-ZmDyP 載體的構(gòu)建

Z.mobilis中Putative DyP-type過氧化物酶基因(GenBank Accession No.Q5NM63) DNA 序列從NCBI 細(xì)菌基因組數(shù)據(jù)庫中得到。以序列信息為依據(jù)，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增編碼區(qū)基因片段(表1)。引物1中，為了遵守引物設(shè)計(jì)原則，保證GC 含量在合適的范圍內(nèi)，將引物中個(gè)別堿基進(jìn)行替換(單個(gè)堿基下有下劃線代表原始?jí)A基被替換)，但翻譯后不改變氨基酸殘基。

以Z.mobilis 基因組DNA 作為模板，F(xiàn)1和R1為引物(表1)，使用Pfu DNA 聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增時(shí)各組分含量為：0.4 mmol/L F1，0.4 mmol/L R1，100 ng DNA 模板，0.2 mmol/L dNTPs，4% DMSO，1×Buffer，1 U Pfu DNA 聚合酶。PCR 條件：95℃5 min；94℃1 min，55℃30 s，72℃2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃10 min。將擴(kuò)增的DNA 進(jìn)行純化，作為模板，進(jìn)行第二次擴(kuò)增，使用F2和R2為引物(表1)。PCR 參數(shù)及條件如第一次擴(kuò)增。將擴(kuò)增的DNA 片段進(jìn)行純化，用NdeⅠ和XhoⅠ進(jìn)行消化，再次純化，然后與NdeⅠ-XhoⅠ粘性末端的pET-21b(+)載體進(jìn)行連接，成為一個(gè)整合有目的片段的質(zhì)粒pET21b(+)-ZmDyP (圖1)。將pET21b(+)-ZmDyP轉(zhuǎn)化入E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過氨芐青霉素抗性和藍(lán)白斑篩選單克隆進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR 和XhoⅠ和NdeⅠ雙酶切驗(yàn)證后進(jìn)行DNA 測序。

圖1 重組質(zhì)粒pET21b(+)-ZmDyP 載體結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Map of the recombinant pET21b(+)-ZmDyP.

1.2.2 序列分析

多序列對(duì)比網(wǎng)址 www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/。

1.2.3 ZmDyP 在E.coli BL21(DE3)/pLysS 中的重組表達(dá)

將測序正確的質(zhì)粒pET-21b-ZmDyP 轉(zhuǎn)化入E.coli BL21(DE3)/pLysS 中，然后挑取單克隆，接種在含有100μg/mL 氨芐青霉素的5 mL 2YT培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件是200 r/min、37℃過夜。然后將活化的細(xì)菌以1∶100(V/V)接種于15 mL 新鮮的2YT 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件與上述一致，直到細(xì)菌OD600為0.8～1.0之間，加入誘導(dǎo)劑IPTG。誘導(dǎo)溫度為30℃，誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間分別為1、2、3和4 h，從而確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間。誘導(dǎo)時(shí)間定為4 h，IPTG 濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0 mmol/L，從而確定最佳IPTG 誘導(dǎo)濃度。

表1 引物DNA 序列Table 1 DNA sequences of primers

在確定的最佳表達(dá)條件下，將菌株接種于500 mL 新鮮的2YT 培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。IPTG 最終濃度0.2 mmol/L，菌液在30℃、200 r/min 條件下培養(yǎng)4 h。然后通過離心的方法收獲菌體，用來進(jìn)行下一步酶的純化實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 ZmDyP 的純化

收獲的菌體用緩沖液(Binding Buffer，25 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5)溶解，緩沖液中含有0.5 mol/L NaCl 及1 mmol/L 苯甲基磺酰氟(PMSF)。用超聲儀來破碎細(xì)胞，將細(xì)胞裂解液于12000× g、4℃條件下離心30 min 獲得上清。在用金屬螯合層析之前，先用0.4μm 過濾膜進(jìn)行過濾，以除去雜質(zhì)。將Ni-Chelating 瓊脂糖柱用結(jié)合緩沖液進(jìn)行平衡后上樣，最后用含有50～200 mmol/L 咪唑的結(jié)合緩沖液進(jìn)行洗脫。小部分收集的蛋白溶液可以通過顏色和SDS-PAGE 來判斷純度，然后合并在一起，用PD-10柱子進(jìn)行除鹽。最后通過超濾裝置將蛋白進(jìn)行濃縮。

1.2.5 ZmDyP 的PAGE 及MALDI-TOF MS 分析

蛋白濃度定量使用Bradford Assay 方法進(jìn)行測定，SDS-PAGE 膠的蛋白顯色使用Coomassie G-250。利用PAGE 分析的方法進(jìn)行蛋白活性的測定，將沒有加熱的和加熱的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后，用25 mmol/L Tris-HCl將膠沖洗1次，然后每隔20 min 用50 mmol/L醋酸鈉緩沖液沖洗，共沖洗2次，再將膠放在含有2.5 mmol/L 底物的50 mmol/L 醋酸鈉緩沖液中，并加入最終濃度為0.1 mmol/L 的H2O2共同孵育10 min。

蛋白樣品經(jīng)除鹽后濃縮到大約10 mg/mL。然后將樣品與等體積的芥子酸混合，用Bruker UltrafleXtrem MALDI-TOF 質(zhì)譜儀測定，通過Flexanalysis 3.3軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.6 ZmDyP 的光譜分析

使用 Thermo Scientific Varioskan Flash 96-well Plate Reader 進(jìn)行300 nm 到700 nm 的波長掃描。使用96孔板時(shí)，每個(gè)孔為上樣200μL，包含40μmol/L ZmDyP 和25 mmol/L Tris-HCl。進(jìn)行第1次讀數(shù)掃描，掃描后加2μL 10 mmol/L H2O2到樣品中，混合后立即進(jìn)行第2次讀數(shù)掃描。10 min 后進(jìn)行第3次掃描。

1.2.7 酶活力測定

一個(gè)酶活力單位定義為：在25℃、pH 4.5條件下，氧化1μmol/L ABTS 所需要的酶量。以ABTS 為底物在96孔板中進(jìn)行酶活力測定。在標(biāo)準(zhǔn)200μL 體系中，反應(yīng)混合液包括50 mmol/L醋酸鈉緩沖液，2.5 mmol/L ABTS，0.1 mmol/L H2O2和0.1μmol/L ZmDyP。ZmDyP、ABTS 和緩沖液在25℃預(yù)溫育5 min，然后通過加入H2O2啟動(dòng)反應(yīng)。反應(yīng)過程的動(dòng)力學(xué)曲線在414 nm 及25℃恒溫條件下進(jìn)行檢測。

終點(diǎn)酶活力測定方法：反應(yīng)混合體系包含同樣濃度的底物和酶，加入H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，在25℃或其他特定溫度下反應(yīng)5 min，然后通過加入200μL 2% SDS 終止反應(yīng)。將樣品在414 nm 進(jìn)行吸光度測定。Km和催化常數(shù)(kcat)通過非線性Michaelis-Menten 模型方程：v=kcat[E]t[S]/(Km+[S])擬合得到，相應(yīng)圖表用軟件 Prism Gradpad Version 6繪制。為了測定pH 對(duì)酶活力的影響，如上述實(shí)驗(yàn)操作，但在pH 2.5～9.5條件下進(jìn)行測定。酶的熱穩(wěn)定性的測定：酶在25℃～75℃條件下孵育20 min，然后在標(biāo)準(zhǔn)條件下測定酶的剩余酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 pET21b(+)-ZmDyP 載體的驗(yàn)證

以Z.mobilis 基因組DNA 為模板進(jìn)行PCR，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測?？梢奪mDyP 的PCR產(chǎn)物在1000 bp 附近有特異性條帶，片段大小與GenBank 中登錄的相符。將重組質(zhì)粒pET21b(+)-ZmDyP 進(jìn)行酶切驗(yàn)證，所切下的片段與預(yù)期結(jié)果相符(圖2)，證明整合載體構(gòu)建成功。

2.2 序列分析

圖2 重組質(zhì)粒pET21b(+)-ZmDyP 的酶切驗(yàn)證Fig.2 Verification of the recombinant plasmid pET21b(+)-ZmDyP by enzyme digestion.M:DNA marker;1:pET21b(+)-ZmDyP;2:pET21b(+)-ZmDyP digested with Nde I;3:pET21b(+)-ZmDyP digested with Nde I and Xho I.

通過 Clustal W 對(duì)比擴(kuò)增 DNA 序列和GenBank 中得到的序列，結(jié)果完全一致，證明了擴(kuò)增基因的正確性。將ZmDyP 的一級(jí)序列與其他4種DyP-type 過氧化物酶(DyPPa，RAH1 DypB，BtDyP 和TyrA)序列進(jìn)行多重序列比對(duì)(圖3)。可見，ZmDyP 與其他DyP-type 過氧化物酶一樣都存在GXXDG 這種保守結(jié)構(gòu)序列。除了GXXDG 結(jié)構(gòu)外，還有一些保守氨基酸殘基(D149，R239，T254和F256)*，形成一個(gè)活性口袋來結(jié)合H2O2。對(duì)于傳統(tǒng)意義上的過氧化物酶來說，His 在催化過程中起到重要作用，而DyP-type 過氧化物酶中Asp 代替His 起到這個(gè)作用。從真菌T.cucmeris Dec 1中得到的晶體結(jié)構(gòu)顯示DyP-type 過氧化物酶的催化機(jī)制可能涉及到保守氨基酸Asp (D171)殘基的搖擺運(yùn)動(dòng)[15]。Roberts 等表征了RHA1 DypB 的晶體結(jié)構(gòu)[25]，在酶的亞鐵血紅素口袋中發(fā)現(xiàn)了(D153，H226，R244，N246和D288)這5個(gè)重要氨基酸殘基，而它們在ZmDyP 中同樣也是保守的。ZmDyP 與其他一些DyP-type 過氧化物酶家族成員的這些共同結(jié)構(gòu)特征顯示它也是一種DyP-type 過氧化物酶。由此，稱它為ZmDyP (Z.mobilis DyP)。

2.3 ZmDyP 在大腸桿菌BL21(DE3)/pLysS 中表達(dá)條件的優(yōu)化

誘導(dǎo)溫度定為30℃，IPTG 濃度為0.2 mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間分別為1、2、3和4 h，結(jié)果如圖4A 所示。由于誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間3 h 和4 h時(shí)表達(dá)水平差不多，但4 h 培養(yǎng)菌體生物量較高，可以滿足后續(xù)研究工作需要，從而確定本研究的最佳誘導(dǎo)時(shí)間為4 h。IPTG 濃度分別為0.1、0.2、0.5和1.0 mmol/L 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4B 所示，可見IPTG 的濃度對(duì)于表達(dá)的影響并不明顯，所以采用IPTG 誘導(dǎo)濃度為0.2 mmol/L。

2.4 C 端帶有6×His tag ZmDyP 的純化

ZmDyP 是從質(zhì)粒pET-21b-ZmDyP 中表達(dá)的，在質(zhì)粒的C 端有6×His tag 融合蛋白。該酶是一種可溶的胞內(nèi)蛋白，超聲后溶解在細(xì)胞破碎產(chǎn)物中，可利用Ni-chelating 樹脂進(jìn)行純化。通過擴(kuò)大培養(yǎng)，1.5 L 2YT 培養(yǎng)基可產(chǎn)大約7.5 g 細(xì)菌(濕重)，經(jīng)純化后計(jì)算各步驟總蛋白、總酶活、比酶活及回收率(表2)。

2.5 ZmDyP 的PAGE 及MALDI-TOF MS分析

圖3 ZmDyP 與其他DyP-type 過氧化物酶的多重序列比對(duì)Fig.3 Multiple sequence alignment of ZmDyP with other members of DyP-type peroxidases family.BtDyP:Bacteroides thetaiotaomicron (Accession No.AA076326);RHA1 DypB:Rhodococus jostii RHA1(Accession No.Q0SE24);TyrA:Shewanella oneidensis MR-1(Accession No.AAN53816).DyPPa:Pseudomonas aeruginosa PKE117(Accession No.ADF43017).Identical residues are shown as white in black shade.The unique GXXDG motif characteristic of DyP-type peroxidases and conserved residues of the active site are indicated by box and asterisks,respectively.

圖4 ZmDyP 在大腸桿菌BL21(DE3)/pLysS 中的表達(dá)及SDS-PAGE 分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of ZmDyp expression in E.coli BL21(DE3) pLyS.Effect of induction time (A) and IPTG concentration (B) on ZmDyP expression.

將超聲破碎的菌體全蛋白和純蛋白進(jìn)行還原型12% SDS-PAGE，結(jié)果如圖5A 所示，可以看到ZmDyP 展示了一條清晰的條帶，分子量大約為36 kDa。而在沒有還原劑的條件下，10% SDS-PAGE 也出現(xiàn)了圖5B 所示的同樣分子量的一條帶，由此可以判斷該酶沒有分子間二硫鍵。ZmDyP 通過MALDI-TOF MS 顯示分子量是35812.21 Da，經(jīng)氨基酸預(yù)測分子量是35745.49 Da。將SDS-PAGE 膠進(jìn)行酶活力染色，可以看到在116 kDa區(qū)域的條帶(無加熱，圖5C，泳道1)，但卻沒有檢測到單體的形式(加熱，圖5C，泳道2)。結(jié)果表明ZmDyP 分子結(jié)構(gòu)是很緊密的，甚至暴露在有SDS 存在的SDS-PAGE系統(tǒng)中，也是以具有酶活力的三聚體的形式存在。根據(jù)SDS-PAGE 測定的ZmDyP 相對(duì)分子質(zhì)量，可以得到線性回歸曲線為y=2.22-0.0188x，R2=0.9978。經(jīng)以上研究確定ZmDyP 單體蛋白分子量約為36 kDa，三聚體蛋白約為108 kDa。

細(xì)菌 DyP-type 過氧化物酶單體分子量從32 kDa 到54 kDa 不等，當(dāng)然也會(huì)以多聚體的形式存在，例如，綠膿桿菌Pseudomonas aeruginosa中的酶是64 kDa 的二聚體[24]，藍(lán)細(xì)菌魚腥藻cyanobacterium Anabaena 中的酶是206 kDa 的四聚體[21]。因此，這些細(xì)菌的亞鐵血紅素過氧化物酶是以不同的大小和不同多聚體的形式而存在的。

表2 純化得率及比活力測定Table 2 Purification yield and enzyme activity analysis

圖5 SDS-PAGE 分析純化的重組酶ZmDyPFig.5 SDS-PAGE analysis of purified recombinatant ZmDyP.(A) Commassie blue-stained gel showing the purification of ZmDyP.M:molecular weight markers;1:soluble fraction of cell lysate prepared from BL21(DE3)/pLysS expressing ZmDyP;2:ZmDyP purified by Ni-chelating Sepharose chromatography.(B)Identificaton of intramolecular disulfide bond gel.M:molecular weight markers;1:ZmDyP without DTT;2:ZmDyP with DTT.(C) Activity-stained gel showing the size of ZmDyP.M:molecular weight markers;1:ZmDyP without heating;2:ZmDyP with heating.

2.6 ZmDyP 的光譜分析

純化后的ZmDyP 溶液呈棕紅色，暗示著在酶的活性位點(diǎn)存在著亞鐵血紅素基團(tuán)。酶在400 nm 處有一個(gè)明顯的亞鐵血紅素酶的特征吸收峰Soret band (圖6)，這在其他DyP-type 過氧化物酶中也是普遍存在的[21-22,25]。在酶中加入H2O2會(huì)導(dǎo)致400 nm 和510 nm 吸收峰降低。10 min 后，酶又逐漸回到靜息狀態(tài)的趨勢。這種現(xiàn)象在其他的含亞鐵血紅素過氧化物酶中也有報(bào)道[11,25]。因此，更加確定了ZmDyP 確實(shí)是一種含有亞鐵血紅素的過氧化物酶。

圖6 ZmDyP 氧化H2O2的光譜吸收峰Fig.6 Spectrophotometric analysis of ZmDyP oxidation of H2O2.

2.7 酶學(xué)性質(zhì)評(píng)價(jià)

pH 對(duì)ZmDyP 酶活力的影響，是以ABTS 為底物，在不同pH (2.5～9.5)緩沖液中進(jìn)行的，結(jié)果如圖7A 所示。最大酶活力是在pH 4.0，pH 4.5以上酶活力會(huì)急劇下降。因?yàn)槊冈趐H 4.0反應(yīng)速度太快，為了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，將ZmDyP 標(biāo)準(zhǔn)狀況下酶活力的測定設(shè)為pH 4.5。對(duì)于大多數(shù)亞鐵血紅素依賴的過氧化物酶而言，無論來源是細(xì)菌[22,24]還是真菌[26-27]，最佳活力都在pH 4.0左右，因?yàn)樗嵝詐H 能增加亞鐵血紅素的氧化能力[28]。溫度對(duì)ZmDyP 酶活力的影響，在標(biāo)準(zhǔn)測定條件下，通過25℃～75℃的溫度范圍進(jìn)行測定，結(jié)果如圖7B 所示，可見最大酶活力是在37℃，比25℃高出大約10%的活力。在37℃以上，酶活力開始下降，75℃沒有檢測到酶活力。熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7C 所示，可見ZmDyP表現(xiàn)中等熱穩(wěn)定性，在50℃加熱20 min 后，大約有85%的剩余酶活力。在55℃以上時(shí)，酶表現(xiàn)得很不穩(wěn)定，在75℃以上酶活力幾乎完全喪失。ZmDyP 的熱穩(wěn)定性與其他細(xì)菌如Anabaena[21]和P.aeruginosa[24]的DyP-type 過氧化物酶是相近的。

ZmDyP 是基于E.coli 的重組酶，它的底物特異性用表3所示的幾種化合物來檢測。在這些底物中，該酶對(duì)2,2-二氨-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)棓表現(xiàn)出最高酶活力，焦酸(Pyrogallol)表現(xiàn)出最低酶活力，兩者相差13倍。細(xì)菌R.jositii RHA1中的DypB 分別以ABTS 和Pyrogallol 為底物時(shí)，對(duì)ABTS 表現(xiàn)出的酶活力比Pyrogallol 高出16倍[25]，但真菌Anabaena sp.strain PCC 7120中的 AnaPX 以 ABTS 和Pyrogallol 為底物時(shí)，表現(xiàn)出的酶活力卻是相當(dāng)水平[25]。藜蘆醇(Veratryl alcohol)是一種木質(zhì)素過氧化物酶的模式底物，在DyP-type 過氧化物酶中目前只有真菌來源的 AjP 和細(xì)菌來源的DypB 和TfuDyP 對(duì)它表現(xiàn)出活性[22,25,27]。對(duì)于底物蒽醌染料(Reactive blue 4)和三芳基甲烷類染料(Crystal violet)，ZmDyP 表現(xiàn)出弱活性。對(duì)偶氮類染料(Azure B)、丁香酸(Syringic acid)、香草酸(Vanillic acid)、愈創(chuàng)木酚(Guaiacol)都無活性。與其他一些已報(bào)道的DyP-type 過氧化物酶來比，ZmDyP 呈現(xiàn)出較窄的底物特異性。

圖7 ZmDyP 的最佳pH 和溫度及熱穩(wěn)定性Fig.7 Determination of optimal pH (A) and temperature dependence of ZmDyP assayed with ABTS as substrate using the endpoint assay (B),and the enzyme’s thermal stability evaluated by incubating at different temperatures for 20 min and its residual activity was determined under standard conditions (C).

表3 重組酶ZmDyP 的底物特異性Table 3 Substrate specificity of the recombinant ZmDyP

3 討論

Z.mobilis 是一株重要的乙醇生產(chǎn)菌株，它可以通過Entner-Doudoroff 途徑生產(chǎn)乙醇，與酵母相比消耗同等質(zhì)量的葡萄糖產(chǎn)生更少的ATP，因此生物量合成較少，相應(yīng)可以提高乙醇對(duì)糖的表觀收率，可能成為發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的一個(gè)優(yōu)勢菌株[29]。那么Z.mobilis 的高乙醇得率是否和自身的氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)？H2O2是氧化脅迫的一個(gè)來源，它能夠形成活性氧自由基，比如羥基自由基和單氧自由基。這些自由基能夠損害細(xì)胞一些重要的組成部分，比如DNA、蛋白和脂類等[30-31]。通過光譜分析證明ZmDyP 可以將H2O2作為底物清除掉，這樣就會(huì)減少一些氧化自由基對(duì)菌體的損害。

本研究首次通過序列分析將Z.mobilis 中的推斷 DyP-type 過氧化物酶基因插入到pET-21b(+)表達(dá)載體中，通過轉(zhuǎn)化E.coli 得到表達(dá)并純化出可溶性目的蛋白。通過Clustal W與其他DyP-type 過氧化物酶進(jìn)行序列分析，證明ZmDyP 中存在GXXDG 保守序列結(jié)構(gòu)和一些保守氨基酸殘基(D149，R239，T254和F256)。通過PAGE 及MALDI-TOF MS 分析，ZmDyP 單體蛋白分子量約為36 kDa，在有活性狀態(tài)下是以同源三聚體形式存在，分子量約為108 kDa。光譜分析表明，酶在400 nm 處有一個(gè)明顯的亞鐵血紅素酶的特征吸收峰，并且能夠以H2O2作為底物。

以上結(jié)果證實(shí) Z.mobilis 中確實(shí)存在DyP-type 過氧化物酶基因，并且這種酶可以清除氧化自由基。酶活力測定表明，ZmDyP 最適pH為pH 4.0，最適反應(yīng)溫度為37℃，表現(xiàn)出中等熱穩(wěn)定性。與RHA1 DypB 進(jìn)行催化效率比較，表明ZmDyP 是一種有更高催化效率的酶。通過對(duì) ZmDyP 表達(dá)純化及性質(zhì)的研究，豐富了DyP-type 過氧化物酶家族的信息，為進(jìn)一步研究ZmDyP 生理功能及后續(xù)的結(jié)構(gòu)和反應(yīng)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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