吳元慶，張媛媛，涂然，劉浩，王欽宏

1 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457

2 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所中國科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300308

近年來，隨著合成生物學(xué)快速發(fā)展為代謝工程提供了強(qiáng)有力的工具，各種設(shè)計(jì)合成的功能元件逐漸應(yīng)用于代謝工程領(lǐng)域，顯示出巨大的應(yīng)用潛力[1-2]。例如，在代謝工程研究中對合成途徑的基因進(jìn)行表達(dá)與調(diào)控是重要研究內(nèi)容，精確控制合成途徑關(guān)鍵酶或異源基因的表達(dá)可以有效地提高產(chǎn)物合成能力和效率[3-4]。啟動(dòng)子是基因表達(dá)調(diào)控的重要元件，但是細(xì)胞內(nèi)源基因的啟動(dòng)子由于經(jīng)常受到細(xì)胞自身代謝網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜調(diào)控，難以提高其效率，而外源基因的啟動(dòng)子在宿主細(xì)胞中經(jīng)常不能發(fā)揮作用，需要替換成其他適合宿主菌的啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)基因的異源表達(dá)。另外合成途徑的不同基因需要進(jìn)行不同程度的表達(dá)，從而使整個(gè)代謝途徑獲得平衡，提高目標(biāo)產(chǎn)物的合成，同時(shí)降低或阻止中間產(chǎn)物的積累[5]。因此，在構(gòu)建合成途徑中需利用不同強(qiáng)度，同時(shí)不受復(fù)雜調(diào)控的啟動(dòng)子。

在大腸桿菌中，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子如Ptac、Pbad及T7啟動(dòng)子等被廣泛用于基因表達(dá)調(diào)控[6-8]。這些啟動(dòng)子需要添加外源誘導(dǎo)物來起始基因的表達(dá)與調(diào)控。盡管通過添加不同濃度的誘導(dǎo)物在一定范圍內(nèi)可以實(shí)現(xiàn)基因不同強(qiáng)度的表達(dá)，但是更多的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子只能實(shí)現(xiàn)是或非的基因表達(dá)，難以進(jìn)行精細(xì)表達(dá)調(diào)控。同時(shí)，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子存在使用成本高、對誘導(dǎo)物濃度超敏感等缺點(diǎn)[9]。因此，近些年來設(shè)計(jì)和篩選新型合成啟動(dòng)子受到越來越多的關(guān)注[10-11]。

設(shè)計(jì)和篩選合成啟動(dòng)子的方法包括定向進(jìn)化、理性或半理性設(shè)計(jì)等[12-14]。定向進(jìn)化的方法是通過易錯(cuò)PCR (Error-prone PCR，Ep-PCR)在原始啟動(dòng)子整個(gè)序列上造成隨機(jī)突變，形成啟動(dòng)子突變文庫，然后結(jié)合報(bào)告基因的表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行篩選，獲得不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子。由于易錯(cuò)PCR引入突變是分布在啟動(dòng)子的全序列上，許多突變是無效的。因此研究人員就根據(jù)啟動(dòng)子的特征保守序列(如?10，?35區(qū)及間隔序列等)，在保持某些特征保守序列不變的情況下，在其他序列通過引入簡并堿基的理性設(shè)計(jì)或半理性設(shè)計(jì)方法，構(gòu)建小規(guī)模、但保持突變多樣性的啟動(dòng)子文庫，從而快速獲得不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子。理性設(shè)計(jì)或半理性設(shè)計(jì)方法由于相對簡單，目前是研究人員關(guān)注的熱點(diǎn)。

本研究在結(jié)合多種啟動(dòng)子設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上[6,11]，設(shè)計(jì)了一條相對簡單、由88個(gè)堿基對組成的合成啟動(dòng)子，在保持?10區(qū)、?35區(qū)以及核糖體結(jié)合區(qū)等序列不變的情況下，在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)、?10區(qū)與?35區(qū)間隔區(qū)引入簡并堿基，直接合成兩條包含啟動(dòng)子區(qū)及酶切位點(diǎn)的簡并配對引物，對引物變性、退火處理后，形成啟動(dòng)子突變文庫，然后以紅色熒光蛋白mCherry 為篩選標(biāo)記，篩選出一系列不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子。對篩出的啟動(dòng)子進(jìn)行測序分析后，得到大腸桿菌合成啟動(dòng)子中相關(guān)區(qū)域堿基分布與啟動(dòng)子強(qiáng)度的關(guān)系。選擇不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子應(yīng)用于生物尼龍單體己二酸前體物——順,順-粘康酸[15-18]合成途徑的優(yōu)化改造，實(shí)現(xiàn)了對合成途徑的精細(xì)調(diào)控，得到目標(biāo)產(chǎn)物順,順-粘康酸(cis,cis-muconic acid，簡稱ccMA)合成增加、中間產(chǎn)物積累減少的工程菌。我們設(shè)計(jì)、篩選的合成啟動(dòng)子也可以用于其他代謝途徑的優(yōu)化與調(diào)控，并為不同體系的啟動(dòng)子設(shè)計(jì)構(gòu)建提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

大腸桿菌AB2834購自美國Escherichia coli Genetic Stock Center，該菌是3-脫氫莽草酸脫氫酶突變菌(aroE353)，即3-脫氫莽草酸到莽草酸合成途徑是阻斷的；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 質(zhì)粒及引物

本研究用引物見表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

本研究所用或構(gòu)建的質(zhì)粒見表2。aroZ、aroY和 catA 分別是來源于克雷伯氏肺炎球菌Klebsiella pneumoniae 的3-脫氫莽草酸脫水酶(3-dehydroshikimate dehydratase)、原兒茶酸脫羧酶(Protocatechuate decarboxylase)和來源于乙酸鈣不動(dòng)桿菌Acinetobacter calcoaceticus 的兒茶酚1,2-雙氧化酶(Catechol 1,2-dioxygenase)的基因[15-16]。這3個(gè)基因組成的異源合成途徑引入大腸桿菌后可以把芳香族氨基酸合成途徑中的3-脫氫莽草酸轉(zhuǎn)化為順,順-粘康酸。AmpR、TcR、CmR和SpeR分別表示氨芐青霉素、四環(huán)素、氯霉素和壯觀霉素抗性。mCherry 是編碼紅色熒光蛋白的基因。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

表2 實(shí)驗(yàn)用質(zhì)粒Table 2 Plasmids used in this study

1.1.3 試劑

限制性內(nèi)切酶均購自 Fermentas 公司，TransStartTMFastPfu DNA 聚合酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；莽草酸、順,順-粘康酸及抗生素(氨芐青霉素、四環(huán)素、氯霉素和壯觀霉素)購自Sigma 公司；質(zhì)粒提取試劑盒及PCR 產(chǎn)物純化回收試劑盒購自Biomiga 公司；BCA 蛋白定量試劑盒Protein Assay Kit 購自Merck 公司，蛋白提取試劑 Protein Extraction Reagent 購自Novagen 公司；其他配制培養(yǎng)基藥品均購自天津國藥集團(tuán)有限公司，分析純。

1.1.4 培養(yǎng)基

液體LB (Luria-Bertani)培養(yǎng)基：10 g 蛋白胨，10 g NaCl 及5 g 酵母膏。固體LB 培養(yǎng)基：10 g 蛋白胨，10 g NaCl，5 g 酵母膏及1.5 g 瓊脂粉。液體及固體LB 培養(yǎng)基pH 7.0，1×105Pa 滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：含有1%葡萄糖的M9基本培養(yǎng)基。其中氨芐青霉素、四環(huán)素、氯霉素和壯觀霉素在培養(yǎng)基中的工作濃度分別為50、25、34和50μg/mL，莽草酸的終濃度為0.04 g/L。氨芐青霉素、四環(huán)素、氯霉素、壯觀霉素及莽草酸均用直徑0.22μm 的濾膜過濾除菌后加入培養(yǎng)基中。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建

質(zhì)粒pKD8.292T 的構(gòu)建：以質(zhì)粒pACYC184為模板，以引物Ptc-EcoRI-5和Ptc-3擴(kuò)增出大約220 bp 的四環(huán)素抗性基因組成型啟動(dòng)子Ptc，以質(zhì)粒pKD8.292為模板，以引物CatA-tc-5和CatA-EcoRI-3擴(kuò)增出1080 bp 的catA 基因，然后這兩個(gè)PCR 產(chǎn)物通過融合PCR 獲得1.3 kb 融合PCR 產(chǎn)物Ptc-catA[19]；Ptc-catA 和pKD8.292分別用EcoRⅠ酶切、回收、連接后獲得重組質(zhì)粒pKD8.292T，這樣組成型啟動(dòng)子Ptc替代原來質(zhì)粒(pKD8.292)中的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Ptac。

質(zhì)粒pKD8.292T-mcherry 的構(gòu)建：以質(zhì)粒pYIP-mCherry 為模板，以引物 mCherry-5及mCherry-3擴(kuò)增出攜帶KpnⅠ及XhoⅠ酶切位點(diǎn)的紅色熒光蛋白 mCherry 基因；以質(zhì)粒pKD8.292T 為模板，以引物 KD8.292-T-5及KD8.292-T-3擴(kuò)增出攜帶KpnⅠ及XhoⅠ酶切位點(diǎn)的線性片段KD8.292T，分別用KpnⅠ及XhoⅠ雙酶切、回收、連接后獲得重組質(zhì)粒pKD8.292T-mCherry。該質(zhì)粒中引入與catA 共用同一啟動(dòng)子的紅色熒光蛋白mCherry 基因，作為篩選用報(bào)告基因。

1.2.2 合成啟動(dòng)子的構(gòu)建及篩選

將合成的啟動(dòng)子引物PL-F 和PL-R (表1)分別用滅菌去離子水配置成10μmol/L 濃度，等體積混合后加入適量10× T4 DNA 連接酶緩沖液，置于85℃水浴10 min，自然冷卻至室溫即可得到攜帶XbaⅠ及NcoⅠ突出末端的多樣性啟動(dòng)子。

將質(zhì)粒pKD8.292T-mCherry 用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和NcoⅠ處理后純化回收，用T4 DNA連接酶與合成啟動(dòng)子連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α，涂布于有50μg/mL 壯觀霉素的固體LB 平板，37℃過夜培養(yǎng)，得到合成啟動(dòng)子多樣性單克隆。

挑取單克隆至每孔有200 mL LB 液體培養(yǎng)基(含50μg/mL 壯觀霉素)的96孔板中，于37℃振蕩培養(yǎng)4 h 后，在激發(fā)波長587 nm，發(fā)射波長610 nm 的條件下[20]檢測紅色熒光強(qiáng)度，同時(shí)測定細(xì)胞生長(OD600)，以紅色熒光強(qiáng)度除以O(shè)D600，即得單位 OD600相對紅色熒光強(qiáng)度(Relative Intensity of Red Fluorescent per OD600，簡稱RIRF/OD600)，依此進(jìn)行合成啟動(dòng)子強(qiáng)度的篩選。

1.2.3 合成啟動(dòng)子序列分析

從篩選出的不同強(qiáng)度啟動(dòng)子按照一點(diǎn)強(qiáng)度間隔，從低到高隨機(jī)選出35條啟動(dòng)子進(jìn)行測序分析。對獲得的序列進(jìn)行不同區(qū)域，包括轉(zhuǎn)錄起始區(qū)和間隔區(qū)的堿基分布統(tǒng)計(jì)，解析堿基分布與啟動(dòng)子強(qiáng)度的關(guān)系。

1.2.4 合成啟動(dòng)子在大腸桿菌順,順-粘康酸生產(chǎn)中的應(yīng)用

將篩選得到的不同合成啟動(dòng)子克隆與質(zhì)粒pKD8.243共轉(zhuǎn)至大腸桿菌AB2834感受態(tài)細(xì)胞，得到順,順-粘康酸合成的不同工程菌株。將不同工程菌株分別接種到有氯霉素及壯觀霉素的液體LB 培養(yǎng)基中37℃、220 r/min 振蕩培養(yǎng)過夜，將該培養(yǎng)液以1%接種量接至同樣液體LB 培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min 振蕩培養(yǎng)8 h，然后以20%的接種量接至發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)36 h，收集發(fā)酵液離心后去上清液利用HPLC 分析發(fā)酵產(chǎn)物。HPLC 分析條件如下：分析柱 Eclipse XDB-C18 column (Agilent Technologies)，上樣量10μL，流動(dòng)相是混合比為9∶1的2%乙醇與純甲醇，流速為1 mL/min，柱溫30℃，UV-Vis 吸收波長為260 nm。每個(gè)樣品重復(fù)3次取平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.5 兒茶酚1,2-雙氧化酶酶活測定

將不同工程菌株分別接種到有氯霉素及壯觀霉素的液體LB 培養(yǎng)基中37℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，將該培養(yǎng)液以1%接種量接至同樣液體LB 培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min 振蕩培養(yǎng)12 h，離心收集菌體。菌體用蛋白抽提試劑處理后離心獲得上清液用于蛋白濃度和兒茶酚1,2-雙氧化酶活測定，酶活測定方法見參考文獻(xiàn)[16]和[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 合成啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)

Harleyd 等[21]對263條大腸桿菌啟動(dòng)子序列比對后發(fā)現(xiàn)存在著保守序列，即?35區(qū)與?10區(qū)，在兩保守序列間間隔序列最優(yōu)長度為17 bp，該序列的堿基分布對啟動(dòng)子強(qiáng)度有很大影響。對原核生物的研究表明[13,22]，?10區(qū)上游隔1 bp 處也有個(gè)保守框，即TG，?13位點(diǎn)堿基為A 或G (二者出現(xiàn)的理論頻率均為50%)，位于轉(zhuǎn)錄起始+1位點(diǎn)上游6個(gè)位點(diǎn)(?1～?6)的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的堿基也具兼并性。據(jù)此設(shè)計(jì)了如圖1所示合成啟動(dòng)子序列。去掉兩端的酶切位點(diǎn)序列(這里是XbaⅠ和NcoⅠ)后，啟動(dòng)子全長為88個(gè)堿基對，其中，N 代表A、G、T、C4個(gè)堿基且4個(gè)堿基在各位點(diǎn)出現(xiàn)的理論頻率為25%，R 與Y 代表堿基A 與G 且2個(gè)堿基在該位點(diǎn)出現(xiàn)的理論頻率為50%，框內(nèi)即為2個(gè)保守區(qū)域序列，?35區(qū)與?10區(qū)，大括號(hào)內(nèi)為隨機(jī)突變區(qū)。

圖1 設(shè)計(jì)的合成啟動(dòng)子序列Fig.1 Sequence design of synthetic promoters.

為了簡化實(shí)驗(yàn)操作，首先合成兩條寡聚核苷酸鏈PL-F 和PL-R (表1)，然后等摩爾混合這兩條寡聚核苷酸鏈，通過變性和退火處理就獲得了合成啟動(dòng)子DNA。同時(shí)在設(shè)計(jì)合成啟動(dòng)子序列時(shí)，引入酶切位點(diǎn)的粘性末端，其中5′端為限制性內(nèi)切酶XbaⅠ的粘性末端，3′端為限制性內(nèi)切酶NcoⅠ的粘性末端(圖1加粗斜體部分)。獲得的合成啟動(dòng)子DNA 可直接用于DNA 連接反應(yīng)，無需進(jìn)一步酶切處理。

2.2 啟動(dòng)子文庫的構(gòu)建與篩選

將上述設(shè)計(jì)合成的合成啟動(dòng)子DNA 與進(jìn)行過相應(yīng)酶切處理的質(zhì)粒pKD8.292T-mCherry 連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞DH5α后形成了啟動(dòng)子文庫。挑選啟動(dòng)子文庫中克隆，以啟動(dòng)子控制紅色熒光蛋白mCherry 的表達(dá)來篩選和檢測啟動(dòng)子的強(qiáng)度(RIRF/OD600)。同時(shí)以含有質(zhì)粒pKD8.292T-mCherry 作為組成型啟動(dòng)子強(qiáng)度的參考。

第1輪篩選檢測了啟動(dòng)子文庫中的5320個(gè)克隆，在第1輪的基礎(chǔ)上，第2輪篩選以RIRF/OD600值相差10為單位梯度，由小至大篩選出RIRF/OD600相對穩(wěn)定的720個(gè)克隆，結(jié)果見圖2。由圖可以看出，所檢測的720個(gè)啟動(dòng)子中約有600個(gè)(從大約第50號(hào)到大約650號(hào))強(qiáng)度是線性增加的。另外這720個(gè)啟動(dòng)子中，最大強(qiáng)度和最小強(qiáng)度之間比值約為15倍。這些啟動(dòng)子基本滿足基因線性表達(dá)調(diào)控的需求。

圖2 合成啟動(dòng)子單位OD600相對紅色熒光強(qiáng)度(圖中水平黑線是組成型啟動(dòng)子Ptc 的相對強(qiáng)度)Fig.2 Relative intensity of red fluorescent per OD600(RIRF/OD600) for synthetic promoters.Solid black line:the relative strength of Ptc constitutive promoter.

2.3 啟動(dòng)子序列分析及表征

為找到啟動(dòng)子強(qiáng)度與突變位點(diǎn)序列之間的對應(yīng)統(tǒng)計(jì)關(guān)系，從含720條啟動(dòng)子的文庫中隨機(jī)篩選出35條(PL01-PL35)不同強(qiáng)度啟動(dòng)子進(jìn)行測序分析，結(jié)果如圖3所示。將35條啟動(dòng)子根據(jù)各自相對強(qiáng)度(RIRF/OD600)大小與參考啟動(dòng)子(組成型啟動(dòng)子Ptc)的相對強(qiáng)度相比，分為3組：即弱啟動(dòng)子(Weak promoter)為參考啟動(dòng)子的2倍以下(包括2倍)；中等強(qiáng)度啟動(dòng)子(Moderate promoter)為2倍以上、3倍以下(包括3倍)；強(qiáng)啟動(dòng)子(Strong promoter)為對照值3倍以上，分別分析隨機(jī)突變區(qū)域堿基分布。

對于不同強(qiáng)度啟動(dòng)子的?10區(qū)的?13位點(diǎn)，啟動(dòng)子強(qiáng)度越大，堿基G 出現(xiàn)的頻率越比堿基A出現(xiàn)的頻率大。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在強(qiáng)弱啟動(dòng)子中二者出現(xiàn)的頻率比恰好相反。在強(qiáng)啟動(dòng)子中堿基G 和堿基A 出現(xiàn)的頻率是2∶1，在弱啟動(dòng)子中是1∶2，而在中等強(qiáng)度啟動(dòng)子出現(xiàn)頻率接近1。

原核生物中，?10區(qū)與?35區(qū)間隔序列大約是16～19 bp。小于15 bp 大于20 bp 都會(huì)降低啟動(dòng)子活性[23]，而研究表明，啟動(dòng)子活性最好時(shí)距離為17 bp[21]，為揭示間隔區(qū)17 bp中除?15至?13以外各位點(diǎn)堿基出現(xiàn)頻率與啟動(dòng)子強(qiáng)弱關(guān)系，分析上述3組啟動(dòng)子，結(jié)果見圖4A。圖4A 結(jié)果表明在強(qiáng)啟動(dòng)子中，此區(qū)域堿基A、G、T、C 出現(xiàn)頻率大致相當(dāng)；弱啟動(dòng)子中，嘧啶堿基出現(xiàn)頻率遠(yuǎn)大于嘌呤堿基出現(xiàn)頻率；中等強(qiáng)度啟動(dòng)子中，A 與C 的頻率較大，與弱啟動(dòng)子相比，嘌呤堿基的頻率增大。

由于在原核生物細(xì)胞中某一基因表達(dá)經(jīng)常取決于轉(zhuǎn)錄及翻譯的起始效率[23]。為了說明該區(qū)域各位點(diǎn)堿基的分布與啟動(dòng)子強(qiáng)度的關(guān)系，不僅分析了各位點(diǎn)各堿基出現(xiàn)的實(shí)際頻率，還分析了各位點(diǎn)嘌呤堿基與嘧啶堿基出現(xiàn)的頻率，結(jié)果見圖4B。在強(qiáng)啟動(dòng)子的6個(gè)位點(diǎn)中除?4位點(diǎn)外，嘌呤堿基均比嘧啶堿基出現(xiàn)的頻率低；在中等強(qiáng)度啟動(dòng)子嘌呤堿基與嘧啶堿基出現(xiàn)頻率差異不大；弱啟動(dòng)子的?2位點(diǎn)為堿基C，僅在?3與?6位點(diǎn)出現(xiàn)嘧啶堿基，嘌呤堿基出現(xiàn)的頻率明顯低于嘧啶堿基出現(xiàn)的頻率。合成啟動(dòng)子特定區(qū)域堿基分布規(guī)律研究將為啟動(dòng)子進(jìn)一步理性或半理性設(shè)計(jì)提供基礎(chǔ)。

圖3 35條不同強(qiáng)度啟動(dòng)子序列及相對強(qiáng)度Fig.3 Sequence of 35 synthetic promoters with different strength.RIRF/OD600:the relative intensity of red fluorescent per OD600.

圖4 不同合成啟動(dòng)子不同區(qū)域堿基分布規(guī)律Fig.4 Base preference of different motif in synthetic promoters.(A) The motif between ?35 and ?10.(B) The sequence of transcriptional initiation.

2.4 啟動(dòng)子文庫的應(yīng)用

順,順-粘康酸是合成尼龍單體己二酸的前體物。野生型大腸桿菌不能合成順,順-粘康酸，需要引入由3-脫氫莽草酸脫水酶、原兒茶酸脫羧酶和兒茶酚1,2-雙氧化酶組成的異源合成途徑，將大腸菌中間產(chǎn)物3-脫氫莽草酸，通過原兒茶酸和兒茶酸轉(zhuǎn)化為兒茶酚轉(zhuǎn)化為順,順-粘康酸[15-16]。

為了驗(yàn)證啟動(dòng)子強(qiáng)度對異源順,順-粘康酸合成途徑的精細(xì)調(diào)控，挑選了5條不同強(qiáng)度啟動(dòng)子，分別為PL01、PL05、PL20、PL31及PL35，其中PL01為弱啟動(dòng)子，PL05及PL20為中等強(qiáng)度啟動(dòng)子，PL31及PL35為強(qiáng)啟動(dòng)子，其強(qiáng)度見圖5A。首先測定了5株菌兒茶酚1,2-雙氧化酶的比活力，結(jié)果見表3。由表可知，合成啟動(dòng)子均可以調(diào)節(jié)兒茶酚1,2-雙氧化酶的比活力，且強(qiáng)度越高，兒茶酚1,2-雙氧化酶的比活力越高。與對照的組成型啟動(dòng)子Ptc相比，可以大幅度提高酶的活性，而且不同合成啟動(dòng)子之間的活性也可以形成較大的差異。根據(jù)表中數(shù)據(jù)顯示，合成啟動(dòng)子之間的比酶活可以相差13倍。

相應(yīng)地，順,順-粘康酸發(fā)酵分析結(jié)果(圖5)也表明合成啟動(dòng)子可以有效地調(diào)節(jié)工程菌生產(chǎn)順,順-粘康酸的能力。與對照的組成型啟動(dòng)子Ptc相比，其產(chǎn)量有大幅提高，最高產(chǎn)量提高了約21倍，合成啟動(dòng)子之間的產(chǎn)量差別也多達(dá)2倍。

另外，由表3和圖5可知，對某一特定途徑，并不是啟動(dòng)子越強(qiáng)產(chǎn)物的產(chǎn)量就越高，啟動(dòng)子強(qiáng)度應(yīng)有一個(gè)閾值，超過這一閾值，產(chǎn)量增加很少或是下降，而在這一閾值范圍內(nèi)，啟動(dòng)子強(qiáng)度稍有加強(qiáng)產(chǎn)物產(chǎn)量即大幅提高，如合成啟動(dòng)子PL01、PL05及PL20對順,順-粘康酸合成的影響。還有隨著啟動(dòng)子強(qiáng)度的增加，中間產(chǎn)物兒茶酚的積累就逐漸減少，甚至在發(fā)酵液中不能檢測到(圖5B)。

表3 不同強(qiáng)度啟動(dòng)子對兒茶酚1,2-雙氧化酶活的影響Table 3 Effect of synthetic promoters with varying strength on catechol1,2-dioxygenase specific activity

圖5 不同啟動(dòng)子影響順,順-粘康酸發(fā)酵生產(chǎn)Fig.5 Effect of synthetic promoters with varying strength on cis,cis-muconic acid production.(A) The relationship of production of ccMA and RIRF/OD600.(B) The accumulation of catechol.

3 討論

啟動(dòng)子文庫的構(gòu)建可以通過Ep-PCR 的方法得到，也可以通過將突變區(qū)域序列設(shè)計(jì)到PCR引物上，在擴(kuò)增目標(biāo)基因時(shí)得到目的基因的啟動(dòng)子文庫，比較兩種方法可以發(fā)現(xiàn)Ep-PCR 的要求較高，而且難以得到足夠的突變體尤其是有效突變體[6]。本研究采用DNA 合成方法得到多樣性突變啟動(dòng)子文庫，操作簡單，在短時(shí)間內(nèi)即可以獲得大量突變體。通過兩輪啟動(dòng)子文庫的篩選，得到表達(dá)強(qiáng)度差異超過15倍的啟動(dòng)子文庫，應(yīng)用于酶活測定及發(fā)酵的啟動(dòng)子均比野生型型啟動(dòng)子強(qiáng)，達(dá)到了預(yù)期目的，而且研究結(jié)果進(jìn)一步說明了啟動(dòng)子能夠?qū)ν緩綄?shí)現(xiàn)精細(xì)準(zhǔn)確的調(diào)控。

在啟動(dòng)子文庫的設(shè)計(jì)中，保守序列間間隔長度為17 bp，雖然早有研究表明在原核生物中保持?35區(qū)與?10區(qū)間距離至關(guān)重要[23]，但對于代謝工程和合成生物學(xué)研究來說，為使元件實(shí)現(xiàn)多樣性及普遍性，還可以改變該區(qū)域序列長度，如19、18、16、14 bp 等。此外，原核生物中RNA聚合酶的σ因子對啟動(dòng)子的識(shí)別及轉(zhuǎn)錄起始有較大影響[24]，而RNA 聚合酶的α亞基也能夠識(shí)別啟動(dòng)子?35區(qū)上游罕見的富含A+T 堿基的保守序列UP 元件DNA，使啟動(dòng)子強(qiáng)度變化1.5～90倍[25]。另有研究表明，啟動(dòng)子中?10區(qū)的保守性沒有?35區(qū)保守性強(qiáng)，其?10位點(diǎn)的堿基T 也可以替換為其他堿基從而降低啟動(dòng)子的表達(dá)強(qiáng)度[26]。而改變作為細(xì)菌中調(diào)控蛋白質(zhì)翻譯的DNA 序列核糖體結(jié)合位點(diǎn)(Ribosome binding sites，RBSs)序列，將其同啟動(dòng)子序列一起亦可以得到表達(dá)強(qiáng)度差異很大的文庫[27]。這為將來進(jìn)一步設(shè)計(jì)提供了方向。

總之，我們的啟動(dòng)子設(shè)計(jì)、篩選和應(yīng)用的研究不僅為啟動(dòng)子進(jìn)一步的理性或半理性設(shè)計(jì)奠定了基礎(chǔ)，而且獲得的啟動(dòng)子元件庫可以用于應(yīng)用于生物合成途徑調(diào)節(jié)與控制。

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