高祺，鄭雪松

上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海 201418

合成生物學(xué)中核心元件(如基因線路、酶、代謝途徑等)的標(biāo)準(zhǔn)化以及合理組裝方式，是建立具有可預(yù)測性和調(diào)控性的代謝途徑，構(gòu)建具有特定功能的新生物體必不可少的基礎(chǔ)性工作[1-7]。近幾年來已經(jīng)設(shè)計了多種基因控制模塊，包括開關(guān)[8-11]、脈沖發(fā)生器[12-13]、振蕩器[14-17]等，這些模塊化的生物部件可以有效調(diào)節(jié)基因表達(dá)、蛋白質(zhì)功能、細(xì)胞代謝或細(xì)胞間相互作用。

群體感應(yīng)(Quorum sensing)是細(xì)胞間通訊的重要方式。它是指單個細(xì)胞通過一種自身合成的自誘導(dǎo)劑分子(Autoinducer)的富集來感知菌群密度的現(xiàn)象。當(dāng)自誘導(dǎo)劑的濃度隨著細(xì)菌密度的增加達(dá)到特定閾值時，某些基因像開關(guān)一樣被打開，啟動后續(xù)一系列基因的表達(dá)?；谌后w感應(yīng)的基因回路能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞行為的同步化，因此在合成生物學(xué)研究中被大量使用[18-21]。

基于群體感應(yīng)的自殺基因回路能賦予宿主菌在一定密度時啟動自殺的特性。在連續(xù)培養(yǎng)條件下可以形成菌群密度的周期振蕩。這樣的振蕩作為基因組件，在合成生物學(xué)上有重要用途。美國杜克大學(xué)的You 等建立起了自殺菌群模型并對其振蕩規(guī)律進(jìn)行了初步的研究[22-23]，其建立的基因回路反映在質(zhì)粒pPopctrl 上，如圖1所示。

該基因回路所利用的群體感應(yīng)原理是AHL-LuxR 這一對自誘導(dǎo)劑-轉(zhuǎn)錄因子分子。在圖中，由luxI 基因編碼的酶催化合成一種高絲氨酸內(nèi)酯分子(Acyl-homoserine lactone，AHL)，它可以在細(xì)胞內(nèi)外自由擴(kuò)散。隨細(xì)胞密度增加，AHL 濃度也將隨之上升，達(dá)到一定閾值時與luxR基因編碼的R 蛋白結(jié)合，生成活化R 蛋白——R*。作為轉(zhuǎn)錄因子的R*可啟動Plux啟動子的轉(zhuǎn)錄，使CcdB 蛋白得以表達(dá)，CcdB 抑制DNA 復(fù)制，從而殺死細(xì)胞。圖中的luxR 和luxI 基因都在lac啟動子的控制之下，可以被IPTG 誘導(dǎo)。

圖1 pPopctrl 質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Structure of plasmid pPopctrl.

可以預(yù)見的是，在這一自殺回路的運(yùn)行過程中，特別是自殺行為啟動以后，由于基因突變能逃避自殺的變異個體會很快出現(xiàn)，這將破壞基因回路的連續(xù)穩(wěn)定運(yùn)行，振蕩信號將隨之迅速衰減。

文中以 pPopctrl 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌top10F’為研究對象，以不同濃度的IPTG 誘導(dǎo)，觀察宿主菌的生長和自殺特征以及在自殺過程中突變菌產(chǎn)生的規(guī)律，并通過基因測序確定變異位點(diǎn)。結(jié)果將為抑制突變個體產(chǎn)生，構(gòu)建更具魯棒性(Robustness)的自殺基因回路提供思路。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株和試劑

質(zhì)粒pPopctrl 由美國Duke 大學(xué)Lingchong You 博士惠贈。宿主大腸桿菌Top10F’菌株由本實(shí)驗室保藏。按照上海捷瑞生物技術(shù)有限公司的一步法質(zhì)粒轉(zhuǎn)化試劑盒說明操作，構(gòu)建工程菌(此菌株即為本文所說的野生型菌株wild type)。

試劑：胰蛋白胨購自美國BD 公司；MOPS(Free acid 3-(N-嗎啡啉)丙磺酸，BBI)、硫酸鎂、氯化鈉、IPTG、Kanamycin、LB 培養(yǎng)基、LB 瓊脂培養(yǎng)基、礦物油、瓊脂糖、溴化乙錠均購自上海生工生物工程有限公司。質(zhì)粒小量提取試劑盒(離心柱型)購自上海捷瑞公司，質(zhì)粒全測序和測序引物合成委托上海邁浦生物科技有限公司。

1.2 細(xì)菌擴(kuò)大培養(yǎng)

從甘油凍存管中刮取含有pPopctrl 質(zhì)粒的top10F’菌株，接種于 LB (含50μg/mL 的Kanamycin)培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)過夜，倍比稀釋后涂布LB 平板，37℃溫育24 h，用接種環(huán)挑取單菌落接種于5 mL LB (含50μg/mL 的Kanamycin)培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)15 h，作為實(shí)驗接種液。

1.3 細(xì)菌的生長特征監(jiān)測和生長-自殺曲線的繪制

細(xì)菌的自殺實(shí)驗在TBK 培養(yǎng)基中進(jìn)行。TBK培養(yǎng)基組成為：10 g/L 胰蛋白胨(BD 公司)、7 g/L氯化鉀、20.93 g /L MOPS 緩沖鹽，用5 mol/L 氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH 至6.0，滅菌后備用。將9μL接種液分別接種于9 mL TBK 培養(yǎng)基(含50μg/mL 的Kanamycin)中，培養(yǎng)基中IPTG 濃度分別為0.01、0.05、0.08、0.1、1 mmol/L，并以不加IPTG 的培養(yǎng)基作為對照。30℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)，間隔1.5～2 h 取樣200μL 于96孔板中先后測定OD600和CFU，繪制生長-時間曲線。

OD600測定使用 Perkin-Elmer Multi-label Plate Reader V3。

1.4 突變菌株的篩選和鑒別

為了鑒別不同時間點(diǎn)樣品中的野生型和突變型，利用二者生長曲線的不同加以區(qū)分。具體做法是：培養(yǎng)過程中不同時間點(diǎn)取樣，倍比稀釋涂布90 mm LB 平板，培養(yǎng)后從中隨機(jī)挑取30個單菌落，接種于96孔板中，每孔中加200μL TBK 培養(yǎng)基，其中含Kanamycin 和1 mmol/L IPTG，接種后每孔再加50μL 礦物油封頂以防蒸發(fā)。預(yù)留2孔，其中TBK 分別含或不含IPTG，此2孔接種野生型菌株分別作為陽性、陰性對照。將該96孔板置于Plate Reader V3中30℃孵育，每隔10 min 振板30 s 并測定OD600，連續(xù)測定18 h 以上。繪制30個孔中30個單菌落的OD-時間生長曲線，與對照孔相比較，確定其中野生型和突變型的數(shù)量。

1.5 突變菌株的質(zhì)粒提取和測序

為了研究突變發(fā)生的位點(diǎn)，在不同時間點(diǎn)和不同IPTG 濃度的菌液樣品中隨機(jī)挑選6株突變菌，LB 擴(kuò)大培養(yǎng)后用試劑盒抽提質(zhì)粒，電泳檢測后送上海邁浦生物技術(shù)有限公司測定質(zhì)粒全長序列。測序結(jié)果用Vector NTI 軟件與pPopctrl質(zhì)粒原始序列比對。

1.6 突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化不含任何質(zhì)粒的top10F’菌株后的生長曲線測定

為了研究是否質(zhì)粒上的突變足以使宿主逃脫群體感應(yīng)自殺行為，文中選擇將2個已被證實(shí)的并已測序的突變質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化到不含任何質(zhì)粒的野生型top10F’宿主菌中去，構(gòu)建只有質(zhì)粒突變的準(zhǔn)野生型細(xì)菌，按照1.3中的方法測定CFU 生長曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同IPTG 條件下野生型的生長曲線和自殺強(qiáng)度

含有pPopctrl 自殺質(zhì)粒的top10F’細(xì)菌在含有不同濃度IPTG 的培養(yǎng)基中的生長曲線如圖2、3所示。從OD600曲線(圖2)可見，IPTG 的濃度對菌群密度有十分明顯的影響，特別是在12 h以后，添加IPTG 的樣品管中濁度呈現(xiàn)顯著差異。但是由于CcdB 蛋白的細(xì)胞毒性體現(xiàn)在抑制了DNA 復(fù)制，而細(xì)胞并不裂解，因此CFU 曲線(圖3)比OD600曲線更能準(zhǔn)確地反映菌群的生長特征。從圖3可以看出，6 h 以前，各管細(xì)菌正常生長，而6 h 以后，細(xì)菌開始大量自殺，CFU值迅速下降，在12 h 前后降至最低值，而細(xì)菌的自殺率與IPTG 濃度呈正相關(guān)。當(dāng)IPTG 濃度為1 mmol/L 時，在短短6 h 時間里，99.8%的細(xì)菌死亡，而IPTG 濃度為0.05 mmol/L 時，這一數(shù)值為98%，對于IPTG 為0.01 mmol/L 的樣品管，其菌群密度一直低于對照管，但在整個實(shí)驗周期內(nèi)，觀察不到明顯的自殺現(xiàn)象。在12 h 以后，菌群密度逐步緩慢回升，但在15 h 后，由于營養(yǎng)條件的限制，菌群密度趨于穩(wěn)定。

圖2 野生型細(xì)菌在不同IPTG 濃度TBK 培養(yǎng)基中的生長曲線(OD600曲線)Fig.2 Growth curves (OD600) of the wild type at various IPTG concentrations.

圖3 野生型細(xì)菌在不同IPTG 濃度TBK 培養(yǎng)基中的生長曲線(CFU 曲線)Fig.3 Growth curves (CFU-time) of the wild type at various IPTG concentrations.

圖3還顯示細(xì)菌開始自殺的時間與IPTG 濃度無關(guān)。在本文的實(shí)驗條件下，群體感應(yīng)發(fā)生作用或者說AHL 分子達(dá)到閾值所需的菌群密度約為5×107個/mL。

上述現(xiàn)象可以根據(jù)自殺基因回路的設(shè)計原理得到合理的解釋。IPTG 濃度越大，lac 啟動子被誘導(dǎo)生成的R 蛋白越多，AHL 分子達(dá)到閾值后，被激活的R*也就越多，從而使lux 啟動子被更頻繁地啟動，大量的CcdB 蛋白引起細(xì)菌自殺。而AHL 濃度的累積僅僅與菌群密度有關(guān)，在其濃度達(dá)閾值前，所有樣品管中的細(xì)菌生長速率相同，因此在同一時刻啟動自殺。

2.2 突變菌株的篩選和自殺過程中突變種群的蔓延

按照1.4中的方法，在每一個時間點(diǎn)取樣涂布平板后隨機(jī)挑選30個單菌落接種96孔板，繪制生長曲線并與陰性(Wild type,no IPTG)、陽性(Wild type with 1 mmol/L IPTG)對照比較。以0.1 mmol/L IPTG 管13.5 h 的樣品為例，曲線如圖4所示。

以圖4為例，隨機(jī)挑選的30個單菌落中，有15個的生長曲線與陰性對照即不加IPTG 的野生型一致，說明這些菌株不再被IPTG 誘導(dǎo)自殺，屬于突變型個體，因此確定在 IPTG 濃度0.1 mmol/L 的樣品管13.5 h 的菌液中突變型比例為50%。

按照這一方法，我們研究了突變型個體隨時間產(chǎn)生并逐漸蔓延的趨勢(圖5)。

圖5 不同IPTG 條件下突變型個體隨時間產(chǎn)生和蔓延的趨勢Fig.5 Tendency of the mutant ratios in different IPTG tubes with time.

從圖3可知，6 h 時細(xì)菌已經(jīng)開始自殺；而通過圖5可見，對于1、0.1、0.08 mmol/L IPTG的3個試管，突變型個體在9 h 時才被篩選出來；而對于0.05 mmol/L 的試管，則到12 h 才有突變型出現(xiàn)。突變型個體的蔓延也與IPTG 濃度密切相關(guān)。IPTG 濃度越大，突變型個體蔓延得越快，伴隨著野生型個體的大量自殺，突變型將迅速統(tǒng)治整個種群。

這一結(jié)果暗示：如果采用連續(xù)培養(yǎng)模式，利用6～9 h 之間的窗口期，就有可能實(shí)現(xiàn)菌群密度的連續(xù)振蕩而不被突變型個體所破壞。另一方面，如果將以IPTG 濃度為參數(shù)的選擇壓力控制在一個合適水平，有可能實(shí)現(xiàn)野生型和突變型和平共存的穩(wěn)態(tài)群落結(jié)構(gòu)。

2.3 質(zhì)粒基因測序?qū)ふ易儺愇稽c(diǎn)

從IPTG 為0.1 mmol/L 的試管所涂布的12 h、14 h 和24 h 的平板上已經(jīng)鑒定為突變型的菌落中，分別隨機(jī)挑選2個，共6個菌落，于LB 培養(yǎng)基中擴(kuò)大后提取質(zhì)粒，電泳驗證后送測序。結(jié)果表明：6個質(zhì)粒中有3個序列完全相同，因此可以歸并為4種質(zhì)粒，代表著4種突變個體，將其分別命名為1227、1408、2407和2412。

這些突變質(zhì)粒上都有外部片段插入，并且插入位點(diǎn)基本一致，都在luxR 基因第565～577位核苷酸之間。插入片段長度為505～628 bp 不等。把插入片段序列在GenBank 中Blast 發(fā)現(xiàn)：這些片段與大腸桿菌IS 家族轉(zhuǎn)座酶基因(IS family transposase gene)高度相似(≥99%)，意味著這是一段轉(zhuǎn)座子。上述4個質(zhì)粒中，1227的插入片段還破壞了664～844 bp 之間的原有序列，其余3個質(zhì)粒都是在一個位點(diǎn)很整齊地插入，且插入位點(diǎn)兩側(cè)有重復(fù)序列，這符合轉(zhuǎn)座子插入的一般特征。圖6展示了luxR-luxI 基因的結(jié)構(gòu)及以1227為例的外源片段插入。

對這些質(zhì)粒而言，外源片段的插入直接破壞了luxR 基因的完整性。突變型個體可能正是借此脫離了群體感應(yīng)并進(jìn)而逃避自殺的。因為所有的序列結(jié)果表明：除了這一區(qū)域外源片段的插入，質(zhì)粒上其他區(qū)域的序列沒有變化。

2.4 轉(zhuǎn)座子的插入足以使突變型避免自殺

圖6 突變型菌株1227的質(zhì)粒上外源片段的插入Fig.6 Insertion of a fragment intervening the luxR gene of plasmid in the mutant 1227.

為了證明質(zhì)粒上發(fā)生的上述插入突變是否足以使細(xì)菌逃脫自殺基因回路控制，以及確定是否突變型個體的染色體上也發(fā)生了相關(guān)突變，我們以不含有任何質(zhì)粒的野生型top10F’為宿主，將1408和2412兩個突變株的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化進(jìn)去，將之命名為1408′和2412′。這兩株菌的染色體與野生型一樣，而只有質(zhì)粒發(fā)生了轉(zhuǎn)座子插入。它們在含有1 mmol/L IPTG 的TBK 培養(yǎng)基中的生長曲線如圖7所示。

結(jié)果顯示：與野生型細(xì)菌明顯的自殺行為不同，1408′和2412′對IPTG 均不敏感，沒有自殺現(xiàn)象發(fā)生，其生長曲線與1408和2412沒有顯著差異。這說明突變型個體擺脫群體感應(yīng)、逃避自殺回路控制是由于外源片段插入luxR 基因造成的。

圖7 野生型、突變型和只有質(zhì)粒突變的準(zhǔn)野生型的生長曲線比較Fig.7 Growth curves of the wild type,mutants and the top10F’ with mutated plasmid in 1 mmol/L-IPTG TBK media.

3 討論

通過基于群體感應(yīng)的自殺回路，可以賦予宿主菌群在達(dá)到一定密度后自殺的特性。這樣的工程化細(xì)菌在以細(xì)菌為載體的靶向給藥、生態(tài)環(huán)境修復(fù)和污染治理等方面有潛在的應(yīng)用價值。在連續(xù)培養(yǎng)條件下，細(xì)菌密度的連續(xù)振蕩可以成為合成生物學(xué)中的一個重要部件。在基礎(chǔ)研究方面，這樣的細(xì)菌模型對自然狀態(tài)下菌群的自殺現(xiàn)象進(jìn)行了簡化，有利于排除各種噪信號干擾，探究群體感應(yīng)現(xiàn)象和自殺基因的進(jìn)化問題。

本研究發(fā)現(xiàn)與細(xì)菌生死存亡相關(guān)的選擇壓力越大，亦即對細(xì)菌的殺傷力越大，突變型個體產(chǎn)生得越早蔓延得也越迅速。這方面的深入研究對總結(jié)殺菌型藥物的給藥劑量和頻率有啟示作用。

本研究發(fā)現(xiàn)群體感應(yīng)自殺行為產(chǎn)生的突變個體都是由于轉(zhuǎn)座子插入luxR 基因造成的。這一方面暗示了基因轉(zhuǎn)座現(xiàn)象在生物適應(yīng)性進(jìn)化方面的作用遠(yuǎn)大于點(diǎn)突變，另一方面也暗示：當(dāng)群體感應(yīng)的效應(yīng)蛋白，如本研究的CcdB，對細(xì)菌個體不利時，進(jìn)化最優(yōu)先的途徑是逃脫群體感應(yīng)，變成“自私”個體，而不是優(yōu)先去破壞效應(yīng)蛋白。

在發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子破壞了luxR 基因完整性以后，我們還研究了突變個體是否仍然產(chǎn)生AHL。初步結(jié)果(本文未提供)顯示結(jié)果是否定的，這符合“轉(zhuǎn)座子會破壞其后面基因的表達(dá)”的既有結(jié)論。AHL 是群體感應(yīng)的主要介質(zhì)，沒有它，意味著群體感應(yīng)系統(tǒng)難以為繼。

以上研究結(jié)論提示：可以從以下3方面入手限制突變型個體的產(chǎn)生蔓延，進(jìn)而維持自殺基因回路的穩(wěn)定。首先，利用細(xì)菌啟動自殺到突變型個體被篩選出來之間的時間差，在這個時間窗口里稀釋菌體、轉(zhuǎn)接種或補(bǔ)料培養(yǎng)，都會保持單一野生種群的穩(wěn)定。第二，細(xì)菌自殺的強(qiáng)度不能太大，在本文的基因回路中，即IPTG 的濃度不能太高。野生型個體生存的空間過小，突變型個體被篩選出來的概率就越大。第三，研究發(fā)現(xiàn)，所有的突變個體轉(zhuǎn)座子都插入在一個基本相同的區(qū)域，暗示著這是轉(zhuǎn)座的一個“熱點(diǎn)”。下一步對該區(qū)域的DNA 序列的深入分析，特別是對該區(qū)域表達(dá)的肽段在整個LuxR 蛋白中所起的作用進(jìn)行研究，將有助于揭示LuxR-AHL 系統(tǒng)分子進(jìn)化的規(guī)律，對該序列優(yōu)化后可以限制轉(zhuǎn)座子插入，有助于構(gòu)建更具魯棒性的基因回路。

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