金紅紅，王健宇，王芳，馬婧，牟彥雙，劉忠華

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)胚胎工程實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150030

Von Hippel-Lindau (VHL)疾病是臨床上常染色體顯性遺傳病，主要死因是腎透明細(xì)胞癌[1]和中樞神經(jīng)系統(tǒng)成血管細(xì)胞瘤引起的并發(fā)癥[2-4]。目前研究表明VHL 為腫瘤抑制基因并且參與多種生物學(xué)功能，VHL 基因編碼的蛋白(以下稱為VHL)可特異性結(jié)合ElonginC、B 亞單位形成pVHL-ElonginC-ElonginB 復(fù)合體，從而阻斷了ElonginABC 復(fù)合物的形成，抑制了RNA 聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄延長，進(jìn)一步達(dá)到抑制mRNA 合成的目的[5-6]。此外VHL 還參與細(xì)胞外基質(zhì)的組裝[7-9]、控制細(xì)胞外圍微管的穩(wěn)定性以及調(diào)控細(xì)胞的凋亡和衰老等過程[10-14]。1993年，Latif 等通過連鎖分析將人VHL 基因定位于染色體3p25-26，并首次成功克隆了人VHL 基因[15]。VHL 基因缺失，會(huì)使發(fā)育至E10.5-E12.5 d 的小鼠胚胎因缺少血管導(dǎo)致死亡[16]。Ma 等構(gòu)建了接近于人VHL 疾病的小鼠模型，采用?-actin 啟動(dòng)子介導(dǎo)的Cre/lox定點(diǎn)重組技術(shù)的方法，VHL 基因敲除后小鼠會(huì)引發(fā)肝血管瘤，在胰腺、腎臟、脾和心臟中同樣會(huì)引發(fā)血管擴(kuò)張和血管再生等[17]。

豬的心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、營養(yǎng)需要以及礦物質(zhì)代謝等都與人類較接近[18-21]，因此可能是較好的VHL 疾病模型。但目前，對豬VHL 基因的研究較少，而且并沒有得到該基因的全長序列。據(jù)此，本研究首先利用3′和5′-RACE 獲得豬VHL 基因全長序列，并應(yīng)用RNAi 技術(shù)，在細(xì)胞和胚胎中對該基因進(jìn)行有效干擾為VHL 疾病模型豬的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

新生巴馬仔豬源自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)基地豬場，在實(shí)驗(yàn)室解剖取材，將取得的各器官組織樣(包括肝臟、腎臟、腦、脊髓、腎上腺、結(jié)腸、胰腺、心臟、睪丸和肺)保存于液氮中。

實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)粒和菌株包括干擾載體pGenesil1.0、大腸桿菌DH5α、原代豬胎兒成纖維細(xì)胞和豬iPS (Induced pluripotent stem cells)細(xì)胞均來自本實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要試劑

LA Taq 酶、PMD-18T、T4 DNA 連接酶、3′-RACE 試劑盒、5′-RACE 試劑盒、限制性內(nèi)切酶均購自TaKaRa 公司；脂質(zhì)體2000和Trizol試劑均購自Invitrogen 公司；膠回收試劑盒購自Axygen 公司；質(zhì)粒小量及大量提取試劑盒購自天根生物有限公司；DNA marker 購自全式金公司、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒來自ABI 公司；DNA 測序由上海立菲生物技術(shù)有限公司完成。

1.3 豬VHL 基因的克隆

克隆豬VHL 基因保守序列：25μL 總體積的PCR 反應(yīng)體系包括:模板1μL，引物各0.5μL，10×PCR 緩沖液2.5μL，dNTPs 2.5μL，rTaq 0.3μL，dH2O 17.7μL。PCR 反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠中電泳并觀察結(jié)果，連接PMD-18T 并測序。共進(jìn)行了3次3′-RACE 擴(kuò)增和5′-RACE 擴(kuò)增，按照TaKaRa公司試劑盒說明書標(biāo)準(zhǔn)操作。引物序列詳見表1。

根據(jù)3′-RACE 和5′-RACE 擴(kuò)增獲得的序列信息，設(shè)計(jì)引物利用重疊PCR 的方法擴(kuò)增VHL基因全長(圖1)。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠中電泳并觀察結(jié)果，連接PMD-18T 載體并測序。

1.4 Real-time PCR 檢測VHL 基因在豬各組織器官中的表達(dá)情況

圖1 豬VHL 基因全長的擴(kuò)增Fig.1 The full length of the VHL gene cloning by overlapping PCR.M:DNA marker;1:VHL gene.

用Trizol 試劑提取了小巴馬豬肝臟、腎臟、腦、脊髓、腎上腺、結(jié)腸、胰腺、心臟、睪丸、肺和pm20(iPS 的一個(gè)系)的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。Real-time PCR 檢測以上10種組織中VHL基因的表達(dá)量。反應(yīng)體系為20μL：上、下游引物各0.4μL，SYBR Mix 10μL，ddH2O 7.8μL，cDNA 1μL。循環(huán)參數(shù)：95℃15 s；95℃5 s，60℃34 s，40個(gè)循環(huán)，95℃15 s，60 1 min℃，95℃15 s。反應(yīng)在ABI 7500 Real Time PCR 儀上進(jìn)行，以β-actin 作為內(nèi)參對照，引物序列具體見表1。

1.5 干擾片段的設(shè)計(jì)及干擾載體的構(gòu)建

干擾片段設(shè)計(jì)：針對豬VHL 基因的CDS 序列及3′非編碼區(qū)，通過Ambion 網(wǎng)站設(shè)計(jì)并篩選出5條shRNA 干擾片段(表2)，并對這些選定片段提交到NCBI 網(wǎng)站上進(jìn)行Blast 比對，確保了只針對VHL 基因起作用。

重組載體構(gòu)建：合成的帶有 BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)的5條寡核苷酸單鏈干擾片段，復(fù)性成雙鏈，連接到經(jīng)BamHⅠ和Hind Ⅲ線性化的pGenesil-1載體。測序正確的5種干擾載體。大量提取后測質(zhì)粒濃度，用于后續(xù)轉(zhuǎn)染。

將pGenesil-1.0-1-pGenesil-1.0-5五種干擾載體以脂質(zhì)體的方式分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染豬iPS 細(xì)胞。24 h 后觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，挑取克隆并純化克隆，收集全部表達(dá)綠色熒光的克隆，提取RNA 并反轉(zhuǎn)為cDNA，凍于?40℃。Real-time檢測5種干擾載體的干擾效率。以β-actin 作為內(nèi)參對照，以豬iPS 細(xì)胞中VHL 基因的表達(dá)量為1(control)，反應(yīng)在ABI 7500 Real Time PCR 儀上進(jìn)行，按照TaKaRa 試劑盒說明書操作。

1.6 豬克隆胚胎的構(gòu)建

篩選高效的干擾載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細(xì)胞系，新霉素篩選2周后進(jìn)行DNA 水平鑒定，陽性細(xì)胞作為核移植的供體細(xì)胞。普通成纖維細(xì)胞為陰性對照，用固定管吸住一個(gè)卵母細(xì)胞，在顯微操作液(添加7.5μg/mL 細(xì)胞松弛素B 的普通操作液)中用注射針吸除第一極體及周圍的部分胞質(zhì)完成去核，并注入一個(gè)供體細(xì)胞于透明帶下，使之與卵母細(xì)胞質(zhì)膜緊密接觸，在融合液中直流電擊(1.2 kV/cm、30μs、2次脈沖)誘導(dǎo)體細(xì)胞與去核卵母細(xì)胞融合形成重構(gòu)胚并使之被激活，然后進(jìn)行胚胎培養(yǎng)。

表1 引物序列與擴(kuò)增片段長度Table 1 Primers and amplified fragment length

表2 豬VHL 基因干擾片段Table 2 shRNA sequences of the pig VHL gene

核移植后48 h 和156 h 分別統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)組和對照組胚胎的卵裂率、囊胚率及囊胚細(xì)胞數(shù)。Real-time PCR 檢測囊胚中VHL 基因的表達(dá)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬VHL 基因的克隆及序列分析

豬VHL 基因序列全長為2725 bp，定位于13號染色體上，通過NCBI 網(wǎng)站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，將VHL 克隆序列與預(yù)測序列進(jìn)行Blast 比對，核苷酸序列相似性為100%。通過基因結(jié)構(gòu)分析網(wǎng)站(http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)分析發(fā)現(xiàn)，5'非編碼區(qū)域?yàn)?5 bp，3′非編碼區(qū)域?yàn)?042 bp，編碼區(qū)為618 bp，共編碼205個(gè)氨基酸。豬VHL 基因與人和小鼠的VHL 基因的cDNA 編碼區(qū)有較高的同源性，同源性分別為79.85%和71.36%，其蛋白與人和小鼠的 VHL 蛋白序列同源性分別為78.08%和76.10%(圖2)。

為了闡述豬VHL 基因及其他物種的VHL 基因的分子進(jìn)化關(guān)系，我們基于氨基酸序列利用MEGA 軟件構(gòu)建系統(tǒng)樹。分析發(fā)現(xiàn)進(jìn)化樹可以分為靈長類、偶蹄類、嚙齒類和節(jié)肢動(dòng)物類。整個(gè)系統(tǒng)樹的分析結(jié)果基本符合常規(guī)分類學(xué)。從分支上可以看出豬的VHL 基因更接近于人類(圖3)。

2.2 豬VHL 基因在各組織中的表達(dá)分析

在出生2 d 的巴馬豬中檢測VHL 基因的表達(dá)情況(圖4)。以β-actin 作為內(nèi)參對照，相對于肝臟中VHL 基因的表達(dá)量，分析其余組織中VHL基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)VHL 基因在肝臟、腎上腺、胰腺、心臟、睪丸中的表達(dá)量顯著高于腎臟、大腦、脊髓、腸和肺等組織(P＜0.01)，而且在iPS 細(xì)胞(pm20)中VHL 基因的表達(dá)量也較高，與肝臟沒有顯著差異(P=0.4626)。

圖2 VHL 序列同源性比對分析Fig.2 Multiple sequence alignment result of VHL protein.

圖3 VHL 基因系統(tǒng)樹分析Fig.3 Phylogenic tree analysis of VHL gene.

圖4 豬不同組織中VHL 基因表達(dá)量的分析Fig.4 VHL expression in tissues of pig.

2.3 VHL 基因的干擾片段在豬iPS 細(xì)胞中的篩選

將pGenesil-1-pGenesil-5干擾載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染豬iPS 細(xì)胞篩選獲得純化的表達(dá)綠色熒光的克隆(圖5A、B)。

Real-time PCR 檢測干擾效率，結(jié)果表明，在pm20中，干擾片段sh1和sh2顯著敲低了VHL基因的表達(dá)，分別降低了64%和72%(圖5C，P＜0.01)，而sh3、sh4和sh5對VHL 基因的表達(dá)沒有顯著影響(圖5C，P＞0.05)。

2.4 VHL 基因的干擾對克隆胚胎發(fā)育的影響

將 sh1和 sh2兩個(gè)干擾片段共同連接到pGenesil-1.0載體上，以電轉(zhuǎn)的方式獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細(xì)胞，作為核供體構(gòu)建克隆胚胎，結(jié)果表明與對照組比較試驗(yàn)組在卵裂率、囊胚率和囊胚細(xì)胞數(shù)上沒有明顯差異(表3)，進(jìn)一步Real-time PCR 結(jié)果顯示試驗(yàn)組克隆囊胚VHL基因表達(dá)量顯著降低了71%(圖6，P＜0.01)，表明所篩選的干擾片段可以有效地在胚胎中敲低豬VHL 基因。

圖5 豬VHL 基因在iPS 細(xì)胞中的干擾克隆及其Real-time 檢測干擾片段的干擾效率Fig.5 VHL RNAi in iPS of pig.(A) Sh1-Sh5 were observed in the light.(B) Sh1-Sh5 were observed in the fluorescence microscopic.(C) Screen of effective interference fragment by Real-time PCR.The interference efficiency of sh1 and sh2 fragment is about 64% and 72% respectively.*:P<0.01.

表3 核移植胚胎發(fā)育數(shù)據(jù)Table 3 Development of nuclear transfer embryos

圖6 Real-time PCR 檢測VHL 在豬克隆胚胎中的敲低效率Fig.6 VHL expression level in knockdown blastocyst by Real-time PCR.The interference efficiency is about 71%.*:P<0.01.

3 討論

我們克隆獲得了豬VHL 基因mRNA 全長，通過對出生2 d 的仔豬組織中VHL 基因的表達(dá)情況分析，豬VHL 基因在肝臟、腎上腺、胰腺、心臟、睪丸中的表達(dá)量較高。根據(jù)克隆獲得的序列信息設(shè)計(jì)了干擾片段，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染豬iPS 細(xì)胞系篩選獲得高效的干擾片段，并在豬克隆胚胎中成功敲低了VHL 基因，從而為后續(xù)獲得VHL 豬疾病模型奠定基礎(chǔ)。

豬VHL 基因定位于13號染色體上，mRNA全長2725 bp，共編碼205個(gè)氨基酸。小鼠和人的VHL 基因蛋白序列同源性為76.10%，而豬和人的VHL 基因蛋白序列同源性為78.08%，而且第60～200氨基酸處僅有4個(gè)氨基酸的差異。說明VHL 基因在人和豬中同源性較高。文獻(xiàn)報(bào)道人VHL 基因的103～124氨基酸編碼的蛋白對腎細(xì)胞瘤的生長和浸染有抑制作用[22]，而豬103～124氨基酸序列和人相同，從而預(yù)測豬VHL基因功能與人更相似。

VHL 基因缺失會(huì)使胚胎致死，因此基因敲低的方法是研究VHL 基因的功能及其構(gòu)建疾病模型的思路之一。2006年，Hong 等利用四環(huán)素誘導(dǎo)重組酶Cre 轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以在特定時(shí)期失活VHL 基因，發(fā)育至E14.5 d 的小鼠胚胎VHL 基因失活后會(huì)引發(fā)組織器官大面積的損壞包括胚胎的血管缺陷和肝臟損壞等，發(fā)育至E15.0 d 的小鼠胚胎VHL 基因失活后卵黃囊的血液循環(huán)受阻[23-24]。在小鼠腎臟中特異性敲除VHL 基因會(huì)引發(fā)腎囊腫等疾病[25]。我們通過相對定量的方法檢測到iPS細(xì)胞(pm20)中VHL基因的表達(dá)量也較高，這與文獻(xiàn)中報(bào)道VHL 基因可與klf4[26]多能性因子相互作用吻合。所以我們選擇豬ips 細(xì)胞為篩選有效干擾片段的細(xì)胞系，Real-time PCR檢測干擾效率可高達(dá)72%。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染干擾載體的豬胎兒成纖維細(xì)胞作為核供體，核移植后檢測囊胚中VHL 基因的表達(dá)量為對照組的29%。另外，VHL 基因敲低后胚胎的卵裂率和囊胚率與對照組相比并沒有明顯的差異，說明VHL 基因敲低并沒有影響豬早期胚胎發(fā)育。我們獲得了VHL基因敲低后的囊胚，驗(yàn)證了VHL 干擾片段在胚胎水平的有效性，從而為后續(xù)構(gòu)建四環(huán)素誘導(dǎo)的VHL 基因敲低轉(zhuǎn)基因豬及組織特異性VHL 基因敲低豬打下基礎(chǔ)。

綜上所述我們克隆了豬VHL 基因并且根據(jù)序列信息設(shè)計(jì)干擾片段，篩選出高效的干擾片段，并獲得了豬VHL 基因高效干擾的細(xì)胞系和克隆胚胎，為后續(xù)構(gòu)建疾病模型豬奠定了基礎(chǔ)。

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