本刊記者 /李 輝

方法學(xué)創(chuàng)新
——記方肇勤團隊的中醫(yī)證候動物實驗研究

本刊記者 /李 輝

方肇勤（左三）團隊部分成員在一次國際會議中的合影

我們本期報道的項目，是獲得2012年度國家科技進步獎二等獎的“病癥結(jié)合動物模型的制備方法與應(yīng)用”項目。這一項目由北京中醫(yī)藥大學(xué)的王偉團隊與上海中醫(yī)藥大學(xué)的方肇勤團隊聯(lián)合完成。我們的報道主要介紹方肇勤團隊的工作。

“辨證論治”：從實踐到實驗

在中醫(yī)臨床中，同一患者在患某種疾病的不同階段，病癥表現(xiàn)不一樣，治療方案即會不同；不同患者患不同疾病，病癥表現(xiàn)有可能相同，治療方案也可以一樣。因此中醫(yī)理論中有“同病異證”、“異病同證”之說，以及對應(yīng)的“同病異治”和“異病同治”。

中醫(yī)臨床認識和治療疾病，不僅辨“病”而且辨“證”，且重點在于對“證”的區(qū)別。這就是中醫(yī)臨床診療的特色之一：“辨證論治”。

所謂“證”，以感冒這一疾病為例，臨床可見發(fā)熱、惡寒、頭疼等癥狀，但由于引發(fā)疾病的原因和機體反應(yīng)性有所不同，又表現(xiàn)為風寒感冒、風熱感冒、暑濕感冒等不同的“證”型?！白C”是比“癥”更廣泛的一個概念。

所謂“辨證”，在傳統(tǒng)中醫(yī)中，是指通過望、聞、問、切收集到患者表現(xiàn)出的癥狀、體征等信息，再通過分析，辨清疾病的病因、性質(zhì)、部位等，最終概括、判斷為某種性質(zhì)的“證”。根據(jù)“證”的特點，對“證”下藥即為“論治”。

作為中醫(yī)理論的重要組成部分，“辨證論治”已經(jīng)有千百年的歷史，即便在今天，對于那些缺少特效藥治療的常見病、難治病，例如手術(shù)指征缺失，化療、放療等方法幾無效果的中晚期惡性腫瘤，中醫(yī)的“辨證論治”依然是許多病人的主要選擇。而經(jīng)過中醫(yī)“辨證論治”之后，的確有一些患者的病情得到了緩解或者生存時間得以延長。

不僅針對惡性腫瘤或罕見病，針對任何患者具體、特殊的發(fā)病病機進行針對性的治療，從而使患者得到個性化、最優(yōu)化的治療，本就是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的一個發(fā)展方向。

對“辨證論治”這一古典理論的繼承和發(fā)展，必然需要大量現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的動物實驗揭示其內(nèi)在的生命科學(xué)依據(jù)。方肇勤領(lǐng)銜的團隊這次得到國家科技進步獎的認可，正是因為他們在這一方面的卓越貢獻。

“辨證論治”的關(guān)鍵，是對“證”的判斷。為了探究證候發(fā)生機制，揭示辨證論治通過何種途徑產(chǎn)生療效，我國中醫(yī)界自20世紀60年代以來，已經(jīng)廣泛展開動物實驗研究。

不過在中醫(yī)界，仍有一些人對動物實驗表示不理解。他們認為，人比大鼠、小鼠高級，中藥方子好不?

正常小鼠爪

爪淡伸展無力

爪消瘦且略紅

爪淡掌略胖

不同個體荷瘤小鼠爪象——同病異證好，人點頭就可以了，還要大鼠、小鼠點頭干什么？

方肇勤認為，“辨證論治”好在什么地方，是通過什么途徑好的，跟西藥不同之處在什么地方，進而能不能在西藥、中藥的基礎(chǔ)上優(yōu)化療效？如果可以優(yōu)化，療效又是如何發(fā)生的？等等，這一系列問題都是生命科學(xué)中需要回答的基本問題。而要回答這些問題，必須按照生命科學(xué)的通例，在實驗動物身上做出解釋。只有實驗成功，醫(yī)生才可以實實在在的心中有數(shù)。

過去半個世紀以來，學(xué)界大都是借鑒西醫(yī)疾病實驗動物造模進行實驗，按照這種思路人們已建立了包括腎陽虛證動物模型在內(nèi)的200余種證候動物模型。但在方肇勤看來，這些研究在產(chǎn)生其積極意義的同時，也暴露出許多不足之處，其核心是缺少標準化、計量化的針對常用實驗動物的“辨證論治”及療效評價的方法。

但是，如何找到新的方法，中醫(yī)界一直沒有突破。

大鼠、小鼠也有“同病異證”

實驗動物中最常用的是大鼠（200～300g）和小鼠（20～30g），兩者分別占到30%、60%的比例。開展小鼠的研究，優(yōu)點是實驗周期短、費用低，這些是實驗中最需要考慮的事情。當然大鼠也有小鼠無法替代的特點，因此一般研究中都是既包括小鼠也包括大鼠的，不同實驗室往往根據(jù)自身的條件和喜好而選擇大鼠或者小鼠。

方肇勤課題組在 2000年之前一直用大鼠做實驗。一次偶然的機會，他的一位碩士研究生在看文獻時發(fā)現(xiàn)，生命科學(xué)界的藥效學(xué)實驗很多時候使用的是小鼠，這一發(fā)現(xiàn)啟發(fā)了方肇勤，為什么不用小鼠試試？于是他同意這位碩士研究生開展對中藥防治肝癌的小鼠研究。

之所以選擇研究肝癌，一則，肝癌是我國的高發(fā)病種，占全世界發(fā)病的一半左右，而且難治；二則，方肇勤自1995年便開始對肝癌進行研究，對這一種腫瘤已經(jīng)有了一定的研究基礎(chǔ)。

至于腫瘤藥效學(xué)實驗方案，就是把腫瘤接種在小鼠腋下，觀察小鼠腫瘤體積和帶瘤生存時間，從而判斷不同治療方案的效果。

這位研究生將一群小鼠分為4組：正常對照、只接種腫瘤不治療（模型對照組）、西藥治療腫瘤對照組，以及中藥治療腫瘤組。原本，這位同學(xué)期望經(jīng)過治療后，小鼠帶瘤生存時間都會得到延長，但是實驗結(jié)果顯示，三個腫瘤組小鼠帶瘤生存天數(shù)的均數(shù)差不多，沒有統(tǒng)計意義，這讓這位同學(xué)十分失望。

方肇勤拿到結(jié)果后，卻發(fā)現(xiàn)了一個現(xiàn)象：不治療模型對照組的小鼠的帶瘤生存期差別比較大，該組小鼠有的死得早，有的死的晚。而用中藥、西藥治療的小鼠死亡時間比較集中，集中在一個時間段內(nèi)死亡?？梢姡舅赖迷绲男∈蟮玫搅酥委煓C會，因而死得晚了點；原本活得長的小鼠經(jīng)過統(tǒng)一模式的治療，反而死得快了。

方肇勤認為，可能患腫瘤小鼠與人類類似，即便是同一種疾病，也存在“證”不同而預(yù)后（指預(yù)測疾病的可能病程和結(jié)局）也不同的情況。實驗中，正是由于采用了單一的治療方法，才導(dǎo)致了不理想的結(jié)果。

從“辨證論治”的角度看，如果在小鼠出瘤的早期，能預(yù)判出那些死得早的小鼠，給予積極的治療；而死得晚的小鼠，不必過度治療。同病異治，這不正是中醫(yī)對腫瘤患者的辨證論治嗎？

基于“同病異證”理論，課題組假設(shè)：他們所飼養(yǎng)的這些實驗小鼠中有一些可能存在氣虛、血虛等虛證，正是有這些虛證的小鼠死得快了一點。

驗證這一假設(shè)，課題組首先遇到的一個問題就是，怎么判斷這些大鼠、小鼠有沒有氣虛、血虛？如果有方法判定氣虛、血虛，那么治療以后，氣虛、血虛有沒有得到改善，又如何通過一個標準化、計量化的指標判斷？

顯然，在所有中西醫(yī)臨床學(xué)科、藥學(xué)學(xué)科，以及針灸推拿等相關(guān)學(xué)科，都存在著這樣的方法學(xué)需求。于是方肇勤率領(lǐng)團隊及一屆屆的研究生，開始在這個方向上深入探索。

上面提及的那位碩士生的讀書時間是1997年到2000年。受到她的研究結(jié)果的啟發(fā)，方肇勤在2000年開始率領(lǐng)團隊針對大鼠、小鼠全面展開研究。

在他們開展該領(lǐng)域研究多年后，還一直有學(xué)者質(zhì)疑，大鼠、小鼠不能與人交流，怎么“望聞問切”？實際上，解決對大鼠、小鼠“望聞問切”的問題，正是方肇勤團隊要攻克的最關(guān)鍵難題。他們最終提出了一整套的解決方案。

例如，對于中醫(yī)所講的氣虛，課題組通過多種方法對實驗鼠作檢測，最后篩選出了兩種：一種叫“曠場”。大鼠、小鼠放在一個空曠的環(huán)境中間，出于好奇和占領(lǐng)領(lǐng)地的習性，它們會兜圈子、前肢離地站立。一般來說，氣盛的大鼠、小鼠跑得積極，氣虛的大鼠、小鼠則有氣無力。由于單位時間內(nèi)大鼠、小鼠跑的距離、站起來的次數(shù)都是可以觀察記錄的，因此就可以判斷一只大鼠、小鼠的氣是不是虛以及虛的程度了。

還有一種叫“抓力”。把大鼠、小鼠放在抓力儀的鐵柵欄上，它會本能地抓住鐵欄。一旦拎起大鼠、小鼠的尾巴往后上方提，大鼠、小鼠就會愈加拽得緊，在掙脫的瞬間會產(chǎn)生一個最大抓力。氣盛的大鼠、小鼠抓得牢，抓力很大，而氣虛的大鼠、小鼠稍微拽一下就掉了。這個力的大小也可以代表氣的盛虛程度。

血虛也有了檢測方法。中醫(yī)講血虛主要是指紅顏色程度下降。課題組把大鼠、小鼠移至標準光源下，用顯微鏡放大，再用標準數(shù)碼相機對它進行拍照，不同時間地點拍照條件一模一樣、標準化。然后對爪、尾的紅色程度進行量化，即可知大鼠、小鼠血虛程度了。

總之，經(jīng)過這一系列的方法，通過“望聞問切”獲取病人證候的辨證方法，在大鼠、小鼠身上，大都可以通過一定的指標進行量化模擬了。如何與大鼠、小鼠交流的難題，終于得以突破。

對大鼠、小鼠是沒辦法摸脈的，但是脈學(xué)的部分指標可以通過做心電圖來檢測。方肇勤課題組制作了一個設(shè)備：一個籠子，兩個電極板一前一后。把大鼠、小鼠放到籠子里，讓其前后肢分別踩在前后兩個電極板上，這樣反映大鼠、小鼠心律的促、結(jié)、代，以及心率的疾、數(shù)、小數(shù)、平、緩、遲等多個常見脈象都可以檢測出來了

從肝癌小鼠推而廣之

雖然對大鼠、小鼠可以進行“望聞問切”并做出“辨證”，但對于腫瘤的預(yù)后判斷這個問題還是沒有解決。

課題組最初想做的是判斷接種腫瘤以后的小鼠、大鼠哪些虛證會死得快，哪些虛證會死得慢。死得快的盡早治療，死得慢可以暫不治療。但試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，并非患有虛證的小鼠先死。原因何在？

2005年的夏天，方肇勤在對多批腫瘤小鼠不同階段的“望聞問切”數(shù)據(jù)反復(fù)分析后，得出了一個突破性的發(fā)現(xiàn)：腫瘤小鼠的預(yù)后，與腫瘤出瘤初期氣虛、血虛、陰虛、陽虛等關(guān)系不是很大，倒是跟腫瘤的大小和增殖速度有關(guān)（中醫(yī)稱為邪毒證）。也就是說，腫瘤出瘤之際，腫瘤長得快的小鼠預(yù)后差、死亡得快，腫瘤長得慢得小鼠，死得慢。

原來，之前方肇勤團隊一直關(guān)心的“虛證”，其實與患腫瘤小鼠的預(yù)后并沒有太大的關(guān)系。與預(yù)后密切相關(guān)的，是另一種“邪毒證”的嚴重程度——腫瘤的生長速度?；A(chǔ)科學(xué)的研究總是這樣，在一條路上努力試錯，在另一條路上柳暗花明。

這個發(fā)現(xiàn)給出的啟示是，如果腫瘤長得快，須趕緊治療；而腫瘤長的慢的小鼠，則可以緩治。在臨床上也是如此。比如肝癌患者，有的病人肝癌長得快、病程發(fā)展快，預(yù)后差；有的人則相反。顯然應(yīng)制定不同的具有針對性的治療方案，同病異治。根據(jù)這個突破性發(fā)現(xiàn)，證候和預(yù)后是什么關(guān)系就解決了。

還有許多問題。例如，其他常用品系的小鼠，是不是也遵守這一規(guī)律？于是課題組又觀察了常用不同品系的小鼠，比如裸鼠、近交系被毛棕褐色的C57小鼠、昆明鼠、ICR小鼠等等。通過實驗，發(fā)現(xiàn)各種鼠類都存在這樣的現(xiàn)象。

再如，肝癌如此，其他病是不是也如此呢？于是課題組又開展了糖尿病，高血壓病、胃潰瘍等多種常見病的大鼠、小鼠實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，常見疾病大鼠、小鼠都普遍存在“同病異證”和“異病同證”的現(xiàn)象，只是程度不一樣，發(fā)生的規(guī)律也不盡相同。

如此，課題組創(chuàng)建的大鼠、小鼠辨證論治方法學(xué)，為中醫(yī)甚至西醫(yī)做實驗尋找動物個體差異，選取針對性的治療方案、探討優(yōu)化治療方案，提供了堅實的方法學(xué)基礎(chǔ)。

克勞德·伯爾納（Claude Bernard），法國生理學(xué)家。1813年7月12日生于維勒弗朗什，1878年1月10日卒于巴黎。1831年在里昂當藥劑師學(xué)徒，1834年到巴黎學(xué)醫(yī)，1843年獲醫(yī)學(xué)博士學(xué)位，1853年獲動物學(xué)博士學(xué)位。曾在主宮醫(yī)院和法蘭西學(xué)院當實習醫(yī)師，后任巴黎大學(xué)生理學(xué)教授，并被選為科學(xué)院院士、醫(yī)學(xué)科學(xué)院院士。早期研究消化生理，1846年發(fā)現(xiàn)胰液在脂肪消化吸收中的重要作用；證明營養(yǎng)包括3個過程：消化、被消化物的運輸及燃燒；1848年發(fā)現(xiàn)肝臟的糖生成作用，之后又證明了肝臟還是貯存和分配糖的器官；1851年發(fā)現(xiàn)血管收縮神經(jīng)，1858年發(fā)現(xiàn)血管舒張神經(jīng)。著作有《實驗醫(yī)學(xué)研究導(dǎo)論》、《胃液及其營養(yǎng)上的作用》、《胰液對脂肪消化的功能》、《交感神經(jīng)對脈管運動的意義》、《肝臟的造糖》等。

京滬合作，共享榮譽

一個傳統(tǒng)學(xué)科要用現(xiàn)代方法來驗證、發(fā)展，阻力是很大的。方肇勤不無感觸地說，“在150年前，西醫(yī)實驗研究的開創(chuàng)階段阻力也很大。當時，醫(yī)學(xué)實驗在國家層面還得不到普遍支持，科學(xué)家大多要自籌經(jīng)費。實驗生理學(xué)的奠基人，法國科學(xué)家克勞德·伯爾納，也是靠他妻子不菲的嫁妝做醫(yī)學(xué)實驗的?！?/p>

方肇勤說：“伯爾納年老時撰寫的《實驗醫(yī)學(xué)研究導(dǎo)論》，我看了幾遍，文中字里行間都充滿了激烈的情緒，可見他當時所承受的壓力，而這種情形與現(xiàn)在中醫(yī)探索性實驗，差不太多?！彼又f，“我們開展這項研究剛開始也非常艱難，壓力也很大，事實上到現(xiàn)在還有一些臨床大夫不理解。但是，要解決中醫(yī)最基本的理論、以及中醫(yī)的機理，肯定不能再像史稱的神農(nóng)嘗百草那樣了，必須做動物研究?！?/p>

好在，科學(xué)界、有關(guān)政府部門對中醫(yī)實驗也越來越重視。在陸續(xù)得到上海市科委、教委和衛(wèi)生局等部門所資助的基金支持后，方肇勤團隊又與北京中醫(yī)藥大學(xué)王偉教授的課題組合作，獲得了國家科技部重大專項的資助。

方肇勤團隊在該領(lǐng)域所開展的探索，在國內(nèi)是最早的。但在這條路上他們并不孤單。北京中醫(yī)藥大學(xué)王偉教授領(lǐng)銜的團隊，也一直在做類似工作。他們主要以小型豬等為實驗對象，因為豬的心臟結(jié)構(gòu)和人的比較接近，他們通過尋找豬的個體差異，來實驗對豬的“辨證論治”。而這樣的探索和方肇勤團隊以患肝癌大鼠、小鼠為實驗對象的研究是一致的。所以，在申報國家科技部的重大專項時，王偉團隊首先想到與方肇勤團隊聯(lián)合申報，最終獲得了國家科技部的資助。而這次申報并榮獲國家科技進步獎，也是兩家聯(lián)合申報并取得成功的。方肇勤教授說，“這是兩個單位和團隊合作的范例。”