王梅梅，熊亞南，劉愛(ài)華，章廣玲

（河北聯(lián)合大學(xué)，河北唐山063000）

淡水藻類(lèi)的分離純化方法探索

王梅梅，熊亞南，劉愛(ài)華，章廣玲

（河北聯(lián)合大學(xué)，河北唐山063000）

以唐山市水源水和終端水為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)淡水藻類(lèi)的分離純化方法進(jìn)行了探索，大致分為以下九種：培養(yǎng)基篩選法、稀釋分離法、平板劃線分離法、離心分離法、毛細(xì)管分離法、小滴分離法、pH值分離法、溫度分離法、抑制劑分離法。同時(shí)探索淡水藻類(lèi)保藏方法。

藻類(lèi)；分離純化；方法

近年來(lái)，對(duì)淡水藻與水體污染之間的關(guān)系的研究有很大發(fā)展，不僅補(bǔ)充了水質(zhì)化學(xué)分析的不足，而且被廣泛用于評(píng)價(jià)、監(jiān)測(cè)和預(yù)報(bào)水質(zhì)的情況［1］。某些藻類(lèi)在環(huán)境保護(hù)中作為水質(zhì)監(jiān)測(cè)的指示生物，可以標(biāo)志水體的污染程度［2］。目前，國(guó)內(nèi)許多城市的供水水源多為湖泊或水庫(kù)，隨著工農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人類(lèi)活動(dòng)所產(chǎn)生的大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和有毒物質(zhì)排入水域，造成水庫(kù)、湖泊的水體污染。由于藻毒素的危害性比較大，目前對(duì)藻毒素的研究越來(lái)越重視。研究藻類(lèi)毒素首先要分離產(chǎn)毒藻種。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 水樣

（1）自來(lái)水水樣

取樣地點(diǎn)：河北聯(lián)合大學(xué)。

取樣時(shí)間：2011年3月～2012年3月。（2）水源水水樣

取樣地點(diǎn)：陡河水庫(kù)。

取樣時(shí)間：2011年3月～2012年3月。

1.1.2 培養(yǎng)基

HGZ培養(yǎng)基［3］：用于大多數(shù)藻類(lèi)的培養(yǎng)，藍(lán)藻生長(zhǎng)最佳；

水生104號(hào)含氮培養(yǎng)基［4］中加入葡萄糖（0.05g／L）：用于大多數(shù)藻類(lèi)的培養(yǎng)；

自制的硅藻培養(yǎng)基：培養(yǎng)硅藻。配方：Ca（NO3）20.01g，MgSO40.01g，K2HPO40.01g，Na-SiO30.025g，KNO30.04g，蒸餾水1000ml。

1.1.3 染液［5］

魯哥氏碘液；中性紅；梅氏蘇木色素等。

1.2 水樣的采集和培養(yǎng)方法

1.2.1 水樣的采集方法

自來(lái)水水樣：酒精燈灼燒水龍頭5min，放水5min，取樣時(shí)在水柱周?chē)c(diǎn)燃用紗布纏繞的火圈，形成局部無(wú)菌區(qū)，用已滅菌的三角瓶取樣。

水廠水和水源水水樣：用75%酒精浸泡過(guò)的塑料桶裝樣采集水廠水水樣，采樣后迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

1.2.2 培養(yǎng)方法

液體培養(yǎng)：在三角瓶中培養(yǎng)，接種比例為V培養(yǎng)基∶V水樣＝1∶2。

固體培養(yǎng)：液體培養(yǎng)基中加入1.5%的瓊脂，培養(yǎng)皿中加入約1cm厚的培養(yǎng)基，加0.2ml藻液，涂布。

培養(yǎng)條件：（28±1）℃、24h連續(xù)光照（2000Lux）靜置培養(yǎng)。

1.3 藻類(lèi)分離方法

1.3.1 培養(yǎng)基篩選法

根據(jù)不同藻類(lèi)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物、離子等需求不同而選出不同的培養(yǎng)基，利用這些培養(yǎng)基對(duì)藻類(lèi)進(jìn)行初步富集篩選。

使用的培養(yǎng)基有：HGZ培養(yǎng)基，水生104號(hào)含氮培養(yǎng)基＋葡萄糖，自制的硅藻培養(yǎng)基。

1.3.2 稀釋分離法［4，6］

用5個(gè)無(wú)菌試管，在第一個(gè)試管中加入蒸餾水10ml，第2～5個(gè)試管中都加入5ml蒸餾水。在第一個(gè)試管中加藻類(lèi)混合液1～2滴，充分振蕩，使其均勻稀釋。然后用消毒移液管吸取第一個(gè)試管中混有藻的液體5ml加入第二個(gè)試管中，如前振蕩，使其均勻稀釋。以后依次同樣加入第3～5試管，并都充分振蕩，使其均勻稀釋。然后分別鏡檢5個(gè)試管，如在1滴中只發(fā)現(xiàn)2～3個(gè)同一藻類(lèi)個(gè)體，將這個(gè)試管作為原液，分別取1滴加到裝有培養(yǎng)基的小指管中。做大量的分離，將其放入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3 平板劃線分離法［4，5］

在篩選出的培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂制成固體培養(yǎng)基，倒平板。用接種環(huán)挑取一環(huán)培養(yǎng)液，在平板上劃線，光照培養(yǎng)，待長(zhǎng)出藻群落后挑取藻體繼續(xù)劃線，培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中鏡檢，直到在平板上長(zhǎng)出單個(gè)藻群落，鏡檢為單種藻類(lèi)為止。該方法可與稀釋法結(jié)合應(yīng)用。

1.3.4 離心分離法［4］

將培養(yǎng)液離心，不同種藻類(lèi)雖都向離心管底部下沉，但由于其大小各不相同而以不同的速率下沉。因此，在離心的過(guò)程中，不同種的藻類(lèi)可相互分離。鏡檢，選擇某種藻類(lèi)含量最多的沉淀物，再加入無(wú)菌水，繼續(xù)離心，一直持續(xù)到可得到較純的藻體。

1.3.5 毛細(xì)管分離法

主要工具是微細(xì)玻璃管。用微細(xì)玻璃管在中央部加熱后拉長(zhǎng)6～10cm，使口徑縮小到0.008～0.16mm。拉長(zhǎng)后的毛細(xì)管供吸取藻體用。在吸取時(shí)，要利用一小段較厚的橡皮管，一端套在吸管上，作為吸取藻體用。在壓出藻體時(shí)，可直接利用吸耳球吹出。將吸入的藻體吹進(jìn)裝有培養(yǎng)基的小指管中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.6 小滴分離法［6］

用微量取液器進(jìn)行操作，把與取液器配套使用的槍尖包扎滅菌備用；將欲分離的樣品制成均勻的懸浮液并作適當(dāng)稀釋；用微量取液器吸取懸浮液，在無(wú)菌的載玻片上以縱橫成行的方式滴數(shù)個(gè)小液滴，用顯微鏡鏡檢；當(dāng)發(fā)現(xiàn)某一小滴內(nèi)只有一種藻體時(shí)，用另一無(wú)菌槍尖將此小滴移入已滅菌的培養(yǎng)基內(nèi)，經(jīng)培養(yǎng)可能得到較純的藻體。

1.3.7 pH值分離法

利用HGZ培養(yǎng)基適合多數(shù)藻類(lèi)的生長(zhǎng)這一特性，將其pH值調(diào)到3，4，5，6，7，7.5，8，8.5，9，將富集的藻類(lèi)混合物接種到其中。在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。這種方法可以分離那些對(duì)pH值要求比較敏感的藻類(lèi)。其中藍(lán)藻多數(shù)適合生長(zhǎng)在堿性水體中。

1.3.8 溫度分離法

此法主要用于金藻和藍(lán)藻的混合液。金藻對(duì)溫度變化敏感，喜低溫，在早春、晚秋大量繁殖。藍(lán)藻一般喜歡較高的溫度，在夏季、秋季大量生長(zhǎng)。

將含有念珠藻和金藻的混合液放在水浴鍋中，在溫度42℃中分別培養(yǎng)6h，12h，18h，24h后，取出放入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

金藻在42℃時(shí)停止運(yùn)動(dòng)，念珠藻也受到一定影響，但相對(duì)較小。

1.3.9 抑制劑分離法

利用的主要藥品有：制霉菌素、苯菌靈、多菌靈等。

利用抑制劑對(duì)真核生物有作用而不影響原核生物的特性來(lái)分離藍(lán)藻。

經(jīng)試驗(yàn)觀察，制霉菌素效果較好。

1.4 藻類(lèi)保藏方法

1.4.1 液體保藏

用于保藏的培養(yǎng)液濃度比正常的培養(yǎng)液濃度高一倍。試管和三角瓶均可。

1.4.2 斜面保藏

制備瓊脂培養(yǎng)基時(shí)，營(yíng)養(yǎng)液濃度也比正常的培養(yǎng)液濃度高一倍，瓊脂含量不宜過(guò)多，一般1～1.5%即可；斜面也不宜過(guò)大。用膠塞或棉塞依不同藻類(lèi)而定。

1.4.3 固液雙相保藏

在斜面保藏培養(yǎng)基中加入液體保藏培養(yǎng)基，液體沒(méi)過(guò)斜面為宜。該培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)在于培養(yǎng)液不易蒸發(fā)，可以較長(zhǎng)時(shí)間保藏藻種。

1.4.4 補(bǔ)充說(shuō)明

應(yīng)用以上三種培養(yǎng)基保藏時(shí)，在接種后均需先放在適宜的光照與溫度條件下，使藻種能夠迅速增殖。在藻體的生長(zhǎng)達(dá)到最大程度前，要把其轉(zhuǎn)移到光線交暗、溫度較低處。用紙遮蓋，可防護(hù)棉塞不沾灰塵并減少蒸發(fā)。保存期間要不斷分養(yǎng)。每一藻種的保存至少分三種不同年齡，最老的用于分養(yǎng)，其余兩種備用。如固體培養(yǎng)物變干，可加入液體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

2 討論

2.1 分離純化方法討論

除已有的分離方法外，根據(jù)不同藻類(lèi)的生理特性，又自行設(shè)計(jì)并試驗(yàn)了多種方法，如溫度分離法、pH分離法、抑制劑分離法等，且效果較好，結(jié)果見(jiàn)表1。

HGZ培養(yǎng)基適合多數(shù)藻類(lèi)生長(zhǎng)，藍(lán)藻生長(zhǎng)最佳，例如念珠藻和席藻；水生104號(hào)含氮培養(yǎng)基＋葡萄糖適合大多數(shù)藻類(lèi)的生長(zhǎng)，如綠藻、金藻等；自制的硅藻培養(yǎng)基適合舟形藻的生長(zhǎng)。平板劃線分離法、毛細(xì)管分離法和小滴分離法均可與稀釋法結(jié)合使用。培養(yǎng)過(guò)程中念珠藻和金藻混雜在一起，可用離心法進(jìn)行分離，離心后念珠藻在下層，金藻在上清液中，去上清，加無(wú)菌水繼續(xù)離心，一直重復(fù)至較純，可用來(lái)分離單細(xì)胞的綠藻和金藻。pH分離法可用來(lái)分離念珠藻和席藻。HGZ培養(yǎng)基的pH調(diào)成堿性后，短時(shí)期內(nèi)只有念珠藻和席藻可以良好生長(zhǎng)，這樣就可把其他種的藻類(lèi)去除掉。注意要及時(shí)觀察念珠藻和席藻的生長(zhǎng)情況，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，它們也會(huì)死亡。溫度分離法主要適用于金藻和念珠藻的混合液中的念珠藻的分離。念珠藻耐高溫，金藻喜低溫，對(duì)溫度變化敏感。苯菌靈、多菌靈屬于農(nóng)藥類(lèi)物質(zhì)，對(duì)人體有害，并且它們對(duì)藻類(lèi)的生長(zhǎng)抑制性不強(qiáng)，不易采用。制霉菌素相對(duì)比較安全，而且對(duì)真核藻類(lèi)的抑制效果比較明顯，例如可以使金藻細(xì)胞裂解，可以殺死柵藻。這樣，對(duì)于金藻和藍(lán)藻或者柵藻和藍(lán)藻的混合液中的藍(lán)藻的分離就可在培養(yǎng)液中加入制霉菌素，可以分離出藍(lán)藻。通常加入制霉菌素的量為0.3～0.4萬(wàn)單位／ml。

2.2 保藏方法討論

由于需要長(zhǎng)期存儲(chǔ)，培養(yǎng)基要長(zhǎng)時(shí)間供給藻體營(yíng)養(yǎng)，所以保藏用的培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分濃度都要較高，一般比正常培養(yǎng)基濃度高一倍。

表1 不同分離方法的比較

表2 幾種藻種最佳保藏方法

柵藻在固體上生長(zhǎng)細(xì)胞容易散落，分散成單個(gè)細(xì)胞，而在液體中則長(zhǎng)勢(shì)良好；在液相中保藏的紡錘藻由于生長(zhǎng)過(guò)于旺盛，細(xì)胞形態(tài)變化很大，且容易衰老，色素體消失；金藻在斜面或有固體的雙相培養(yǎng)基中不能正常生長(zhǎng)，鞭毛脫落，細(xì)胞膨大，外觀看變黃、粘稠，細(xì)胞死亡；舟形藻在自制的硅藻培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最好，由于舟形藻具殼，比較硬，又有游動(dòng)的性質(zhì)，因此在固體培養(yǎng)基中幾乎不生長(zhǎng)，所以用液體保藏；藍(lán)藻門(mén)的三種：念珠藻、席藻都需要良好的通氣條件，所以必須用棉塞 （試管）或紗布 （三角瓶）。念珠藻在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，但是藻鏈變短，細(xì)胞變大，且生長(zhǎng)緩慢；另外兩種在固體培養(yǎng)基上幾乎不生長(zhǎng)。念珠藻在純液體中生長(zhǎng)太快，易衰老死亡，最長(zhǎng)只能維持半個(gè)月時(shí)間；而在三角瓶中的固液雙相保藏效果最佳，可以保藏?cái)?shù)月。席藻在試管中用固液雙相保藏效果最好，而在三角瓶的液體培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)迅速，藻絲聚集成團(tuán)或者培養(yǎng)液變紅，這都是衰老的標(biāo)志。

保藏的藻種需要定期轉(zhuǎn)接活化，除念珠藻需要短期就進(jìn)行轉(zhuǎn)接，一般三個(gè)月轉(zhuǎn)接一次；其余藻種可保藏較長(zhǎng)時(shí)間，一年轉(zhuǎn)接一次即可。

3 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)對(duì)唐山市水源水和終端水中藻類(lèi)進(jìn)行富集培養(yǎng)、分離純化。除已有的分離方法外，根據(jù)不同藻類(lèi)的生理特性，又自行設(shè)計(jì)并試驗(yàn)了多種方法，如溫度分離法、pH分離法、抑制劑分離法等，且效果較好。藍(lán)藻分離可以采用培養(yǎng)基初步篩選法；平板劃線分離法、毛細(xì)管分離法和小滴分離法均可與稀釋法結(jié)合使用，分離單細(xì)胞藻類(lèi)，如綠藻、金藻；溫度分離法可以分離較耐高溫的藻類(lèi)，抑制喜低溫藻的生長(zhǎng)，從而達(dá)到分離目的。

同時(shí)探索各藻種的最佳保藏方法，保藏用的培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分濃度都要較高，一般比正常培養(yǎng)基濃度高一倍。念珠藻、席藻等藍(lán)藻適宜用固液雙相培養(yǎng)基保藏；舟形藻、月牙藻、柵藻、金藻適宜用液體培養(yǎng)基保藏；另外保藏的藻種需要定期轉(zhuǎn)接活化。

［1］張經(jīng)浩.論藻類(lèi)植物的經(jīng)濟(jì)價(jià)值及其對(duì)人類(lèi)的意義 ［J］.安徽教育學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，18（3）：79－81.

［2］房英春，蘇寶玲.藻類(lèi)與人類(lèi)的關(guān)系 ［J］.特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)植物，2001，（12）：21.

［3］沈韞芬，顧曼如，施之心，等.微型生物監(jiān)測(cè)新技術(shù) ［M］.北京：中國(guó)建筑工業(yè)出版社，1991：146－147.

［4］華汝成.單細(xì)胞藻類(lèi)的培養(yǎng)與利用 ［M］.北京：農(nóng)業(yè)出版社，1986：272－356.

［5］朱浩然.植物制片技術(shù)學(xué) ［M］.北京：人民教育出版社，1960.

［6］湛江水產(chǎn)學(xué)校.海洋餌料生物培養(yǎng) ［M］.北京：農(nóng)業(yè)出版社，1980.

Separation and Purification of Algae in the Fresh Water

WANG Mei-mei，XIONG Ya-nan，LIU Ai-hua，ZHANG Guang-ling
（Hebei Union University，Tangshan Hebei063000 China）

Taking the source water and end-pipe water in Tangshan Municipality as the experimental materials，we discuss the separation and purification of the algae in the fresh water.There are about nine methods，namely substrate screening method，dilution separation method，streak plate separation method，centrifugation separation method，capillary separation，drop separation，pH separation，temperature separation and inhibitor separation.The storing of the algae is also discussed in the paper.

algae；separation and purification；method

X83

：A

：1673－9655（2013）02－0118－04

2012－08－29

唐山市重點(diǎn)資助項(xiàng)目（12130211A）。

王梅梅 （1980－），女，衡水人。河北聯(lián)合大學(xué)講師。主要研究方向：淡水藻類(lèi)。