蔣奡，王忠敏，張麗云，茅愛武，劉芬菊

胰腺癌是一種高度惡性的腫瘤，放射治療是目前治療胰腺癌、預(yù)防術(shù)后復(fù)發(fā)、延長患者生存期及提高生活質(zhì)量的重要手段之一［1］。臨床上用于內(nèi)照射治療的放射性粒子包括125I、103Pd等，Nath等［2］、Wang等［3］和Reniers等［4］分別使用103Pd及125I粒子行細(xì)胞照射實驗，得出103Pd比250 KvpX線及125I比60Coγ射線的相對生物學(xué)有效性分別為1.24和1.39。125I主要發(fā)射27.4 keV和31.4 keV的X線和35.5 keV的γ射線，可使乏氧細(xì)胞再氧化，增加了腫瘤細(xì)胞的放射敏感性，且不易損傷正常組織［5-6］，125I的t1/2為60.1 d，可提供約200 d的持續(xù)照射，以上特點使125I粒子在我國得到了臨床醫(yī)師的認(rèn)可和廣泛應(yīng)用［7-8］。

目前胰腺癌細(xì)胞種類很多，如Panc-1、Sw1990、P3、Capan-1、Capan-2、Aspc-1、Hs766T等［9］。根據(jù)美國模式培養(yǎng)物保藏所（ATCC）資料顯示，Sw1990細(xì)胞來源于人胰腺癌的脾臟轉(zhuǎn)移灶，Panc-1細(xì)胞是人胰腺導(dǎo)管上皮癌。本研究采用125I粒子持續(xù)照射，通過集落形成實驗、細(xì)胞凋亡率檢測、細(xì)胞周期檢測、3H-TDR摻入實驗比較照射后兩種細(xì)胞增殖抑制的主要機(jī)制及生物學(xué)效應(yīng)是否存在差異。

1 材料和方法

1.1 材料

人胰腺癌Sw1990細(xì)胞株及Panc-1細(xì)胞由中科院上海細(xì)胞庫提供。BT-125-1型125I粒子由上海欣科醫(yī)藥有限公司提供。DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自德國Biotrom公司，0.25%胰酶購自美國HyClone公司、AnnexinV/PI凋亡試劑盒購自美國Invitrogen公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

Sw1990及Panc-1細(xì)胞體外培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基內(nèi)加入10%胎牛血清，細(xì)胞倍增時間分別為64 h和52 h，用0.25%胰酶傳代。細(xì)胞傳代后生長至指數(shù)生長期時進(jìn)行照射。

1.3 照射裝置

根據(jù)文獻(xiàn)報道，采用Gray實驗室125I粒子離體照射模型［10］，模型為抽屜式結(jié)構(gòu)，分為兩層，下層放置125I粒子，14枚粒子以35 mm為直徑環(huán)形排布，上層為細(xì)胞培養(yǎng)板，放置直徑為35 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿（圖1）。細(xì)胞培養(yǎng)平面的吸收劑量以及照射所需的時間通過測量和計算得出。實驗照射使用平均初始活度為111 MBq（3 mCi）的125I粒子，細(xì)胞培養(yǎng)平皿的初始劑量率為12.13 cGy/h，分別給予2、4、6、8 Gy的照射，在持續(xù)照射期間，粒子照射模型放置在鉛盒內(nèi)以防止放射性污染，鉛盒放置在孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。另設(shè)一組空白對照，照射組及對照組均設(shè)3個平行樣本。

圖1 125I粒子持續(xù)照射裝置

1.4 克隆形成實驗

Sw1990及Panc-1細(xì)胞培養(yǎng)至指數(shù)生長期時，用含EDTA的胰酶消化成單細(xì)胞，分別接種于不同細(xì)胞數(shù)的培養(yǎng)皿中，加入2 ml培養(yǎng)液，待細(xì)胞貼壁后分別行0、2、4、6、8 Gy照射，照射后細(xì)胞置孵育箱培養(yǎng)14 d，培養(yǎng)過程中3 d換1次新鮮培養(yǎng)液。14 d后用甲醇固定，吉姆薩染色后顯微鏡下計數(shù)（50個細(xì)胞以上為1個集落形成單位），實驗重復(fù)3次，每個劑量點設(shè)3個平行樣本，計算集落形成率（PE）及細(xì)胞存活率（SF）。

1.5 細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期檢測

1.5.1 凋亡率檢測Sw1990及Panc-1細(xì)胞照射達(dá)到相應(yīng)吸收劑量（2、4、6、8 Gy）后，與對照組（0 Gy）一起繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，離心洗滌后重懸，加入AnnexinV及PI染色后，置冰上送流式細(xì)胞儀檢測。每組均設(shè)3個平行樣本并重復(fù)3次實驗。

1.5.2 細(xì)胞周期檢測兩種細(xì)胞照射達(dá)到相應(yīng)吸收劑量（2、4、6、8 Gy）后，與對照組一起繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，離心洗滌，加入體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇固定過夜。流式細(xì)胞儀檢測前離心去掉乙醇，加入RNA酶分解RNA，并行PI染色，上機(jī)檢測。每組均設(shè)3個平行樣本并重復(fù)3次實驗。

1.6 3H-TDR摻入實驗

細(xì)胞增殖時需要利用胸腺嘧啶核苷酸（TDR），若將合成DNA的前體物質(zhì)胸腺嘧啶核苷酸用放射性同位素3H標(biāo)記，合成3H-TDR，加入到培養(yǎng)體系中，即可被細(xì)胞攝取而摻入到DNA分子中。培養(yǎng)終止后，測定腫瘤細(xì)胞內(nèi)3H-TDR的摻入量，與對照組比較，反映出照射后細(xì)胞DNA合成情況。分別計數(shù)Sw1990及Panc-1細(xì)胞，接種相同的細(xì)胞數(shù)（1×105個細(xì)胞）至35 mm培養(yǎng)皿中，貼壁后行125I放射性粒子持續(xù)照射，照射劑量分別為2、4、6、8 Gy。照射后3 h每個照射皿注入10μl的3H-TDR，加入后24 h收獲細(xì)胞，加入2 ml閃爍液，用液體閃爍計數(shù)儀檢測細(xì)胞放射量。每個劑量設(shè)3個平行樣，另設(shè)3個對照皿。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SAS9.1（NC，USA）軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析并擬合細(xì)胞存活曲線，Excel 2007（CA，USA）繪圖。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞克隆形成率

14 d后計數(shù)各劑量點克隆數(shù)（計數(shù)50個細(xì)胞以上的為1個集落形成單位），計算各劑量點的SF（照射組PE/對照組PE×100%），根據(jù)線形二次模型對SF與劑量之間的關(guān)系進(jìn)行擬合，擬合方程為SF=e-αD-βD^2，求出SF2（2 Gy時的SF擬合值），結(jié)果見圖2。經(jīng)計算，Sw1990細(xì)胞的SF2為0.766±0.063，Panc-1細(xì)胞的SF2值為0.729±0.045，經(jīng)獨立樣本t檢驗，兩種細(xì)胞的SF2差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 細(xì)胞擬合存活曲線

2.2 細(xì)胞凋亡率

照射結(jié)束后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，染色并上機(jī)送檢，結(jié)果見圖3。

圖3 隨照射劑量增高，兩種胰腺癌細(xì)胞凋亡率逐漸增高

2.3 兩種細(xì)胞照射后的細(xì)胞周期

見表1。

表1 兩種細(xì)胞照射后的細(xì)胞周期（±s）

表1 兩種細(xì)胞照射后的細(xì)胞周期（±s）

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2.4 3H-TDR摻入實驗

經(jīng)液體閃爍計數(shù)器測定，Sw1990細(xì)胞的3HTDR放射量隨照射劑量增高逐漸降低，6 Gy時達(dá)到最低，8 Gy時放射量增高，但明顯低于4 Gy。Panc-1細(xì)胞的3H-TDR放射量也隨照射劑量增高逐漸降低，6 Gy時達(dá)到最低。計算細(xì)胞DNA合成率，設(shè)對照組3H-TDR放射量為1（圖4）。

圖4 兩照射組DNA合成率

經(jīng)方差分析，Sw1990及Panc-1細(xì)胞在2 Gy劑量照射下，3H-TDR放射量與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明2 Gy的累積照射劑量可能不足以抑制這兩種細(xì)胞的DNA合成。兩種細(xì)胞3HTDR放射量在4 Gy比6 Gy、4 Gy比8 Gy時差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但6 Gy比8 Gy的差異則無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），兩種細(xì)胞各劑量組之間差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。Sw1990、Panc-1細(xì)胞在8 Gy劑量照射后的3H-TDR放射量均比6 Gy時高，且Sw1990細(xì)胞增幅更為明顯，可能是因為Sw1990細(xì)胞倍增周期更長，在累積劑量達(dá)8 Gy時，細(xì)胞已完成了部分DNA修復(fù)工作。

3 討論

放射治療是治療腫瘤的有效手段，臨床上常用的放射性粒子包括125I、103Pd、131Cs等，具有劑量率低，可反復(fù)植入、適形照射的特點，與外照射相比提高了腫瘤靶區(qū)的照射劑量，降低了周圍正常組織的照射損傷，減少了并發(fā)癥的發(fā)生。

腫瘤細(xì)胞放射致死主要是發(fā)生了增殖性死亡，即細(xì)胞經(jīng)過照射后雖然形態(tài)依然存在，但已不能無限分裂，克隆形成實驗?zāi)芎芎玫胤从畴x體細(xì)胞的分裂增殖特性。目前的研究認(rèn)為，照射所致的細(xì)胞凋亡及G2/M期阻滯是其抑制腫瘤生長的主要方式，這與我們的研究結(jié)果相符。研究125I治療前列腺癌患者的學(xué)者認(rèn)為其是通過下調(diào)抑制細(xì)胞凋亡的Bcl-2蛋白的表達(dá)及影響Caspase家族從而產(chǎn)生抑制作用［11］，也有學(xué)者認(rèn)為改變DNA甲基轉(zhuǎn)移酶類型也是機(jī)制之一［12］。3H標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷酸作為DNA合成的原料之一，當(dāng)DNA受到損傷時其合成能力下降，因此3H-TDR摻入率也會下降，但修復(fù)細(xì)胞DNA損傷時也需使用3H-TDR，其摻入量又會有所升高，測定腫瘤細(xì)胞內(nèi)的3H-TDR的放射量可以反映細(xì)胞DNA合成量。但總的放射量是由細(xì)胞DNA合成抑制和DNA損傷修復(fù)共同作用的結(jié)果。究竟何種劑量下DNA合成抑制程度最大尚少見報道。本實驗使用125I粒子完成0、2、4、6、8 Gy劑量的照射后，采用克隆形成實驗檢測照射后細(xì)胞體外分裂能力、凋亡率及細(xì)胞周期以及3H-TDR摻入實驗探究照射后的細(xì)胞DNA合成情況。結(jié)果表明，在0～8 Gy的持續(xù)照射下，Panc-1及Sw1990細(xì)胞克隆形成率隨照射劑量增加而逐漸減少，反映細(xì)胞放射敏感性指標(biāo)SF2在兩者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Panc-1細(xì)胞在劑量為6 Gy時G2/M期阻滯達(dá)到最大，而Sw1990細(xì)胞則在8 Gy時達(dá)到最大，這可能與Sw1990細(xì)胞倍增周期更長有關(guān)（52 h比64 h），該范圍內(nèi)兩種胰腺癌細(xì)胞的放射敏感性無顯著差異，作為實驗對象選擇時無差異性。

放射性粒子組織間近距離照射已被證明在抑制腫瘤生長方面有顯著療效，進(jìn)一步探究其產(chǎn)生作用的分子機(jī)制以及治療不同腫瘤時的最適劑量是未來亟待解決的問題。

［1］吳巍巍，趙玉沛，廖泉，等.人胰腺癌細(xì)胞株放射敏感性的體外研究［J］.中華肝膽外科雜志，2004，10：821-823.

［2］Nath R，Bongiorni P，Chen Z，et al.Dose rate dependence of the relative biological effectiveness of103Pd for continuous low dose rate irradiation of BA1112 rhabdomyosarcoma cells in vitro relative to acute exposures［J］.Int J Radiat Biol，2005，81：689-699.

［3］Wang J，Wang J，Liao A，et al.The direct biologic effects of radioactive125I seeds on pancreatic Cancer cells PANC-1，at continuous low-dose rates［J］.Cancer Biother Radiopharm，2009，24：409-416.

［4］Reniers B，Verhaegen F.The microdosimetry of low-energy photons in radiotherapy［J］.Radiat Prot Dosimetry，2006，122：401-403.

［5］Dale R，Carabe-Fernandez A.The radiobiology of conventional radiotherapy and its application to radionuclide therapy［J］.Cancer Biother Radiopharm，2005，20：47-51.

［6］Roeder F，Timke C，Uhl M，et al.Aggressive local treatment containing intraoperative radiation therapy（IORT）for patients with isolated local recurrences of pancreatic Cancer：a retrospective analysis［J］.BMC Cancer，2012，12：295.

［7］卓水清，陳林，張福君，等.125I放射性粒子植入術(shù)后患者周圍輻射劑量的監(jiān)測［J］.癌癥，2007，26：666-668.

［8］王忠敏，陳克敏，金冶寧，等.CT引導(dǎo)下植入125I放射性粒子治療胰腺癌的臨床應(yīng)用［J］.臨床放射學(xué)雜志，2008，27：1730-1735.

［9］Zhang Y，Li M，Wang H，et al.Profiling of 95 microRNAs in pancreatic Cancer cell lines and surgical specimens by real-time PCR analysis［J］.World J Surg，2009，33：698-709.

［10］王濟(jì)東，王俊杰.放射性125I粒子離體照射模型建立及持續(xù)照射對胰腺癌細(xì)胞PANC-1抑制作用的研究［C］.2007第六屆全國放射腫瘤學(xué)學(xué)術(shù)年會論文集，2007.

［11］廖安燕，王俊杰，趙勇，等.125I粒子照射誘導(dǎo)人前列腺癌細(xì)胞凋亡的實驗研究［J］.中華放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)雜志，2007，27：311-313.

［12］Ma JX，Jin ZD，Si PR，et al.Continuous and low-energy125I seed irradiation changes DNA methyltransferases expression patterns and inhibits pancreatic cancer tumor growth［J］.J Exp Clin Cancer Res，2011，30：35.