崔淑芹

（德州學院醫(yī)學系，山東 德州 253023）

葛根素對急性乙醇中毒大鼠腦內(nèi)阿片肽和多巴胺的調(diào)控作用

崔淑芹

（德州學院醫(yī)學系，山東 德州 253023）

目的：檢測葛根素對急性乙醇中毒大鼠皮層、小腦、海馬和紋狀體內(nèi)阿片肽和多巴胺（DA）表達水平的調(diào)控作用，為臨床防治乙醇中毒和開發(fā)中藥葛根提供依據(jù)。方法：雄性SD大鼠24只隨機分為對照組、乙醇中毒組和葛根素組，每組8只，采用放射免疫法檢測各組大鼠皮層、小腦、海馬和紋狀體內(nèi)β－內(nèi)啡肽（β－EP）、強啡肽（DnyA）和亮腦啡肽（L－EK）表達水平，采用高效液相色譜法檢測各組大鼠各腦區(qū)DA、多巴克（DOPAC）和高香草酸（HVA）的表達水平，并計算（DOPAC＋HVA）／DA的比值。結(jié)果：與對照組比較，乙醇中毒組和葛根素組大鼠皮層內(nèi)β－EP、DnyA和L－EK表達水平降低（P＜0.01），皮層、小腦、海馬和紋狀體內(nèi)DA、DOPAC和HVA表達水平均升高 （P＜0.01）；與乙醇中毒組比較，葛根素組大鼠皮層內(nèi)β－EP、DnyA和L－EK表達水平升高（P＜0.05，P＜0.01），DA（P＜0.01）、DOPAC（P＜0.01）和 HVA表達水平均降低，小腦、海馬和紋狀體內(nèi)所有指標表達水平均降低（P＜0.05，P＜0.01），皮層、小腦和海馬內(nèi)（DOPAC＋HVA）／DA比值升高，紋狀體內(nèi)該比值降低（P＞0.05）。結(jié)論：葛根素對急性乙醇中毒造成的腦組織損傷有保護作用，其機制可能與葛根素對腦內(nèi)阿片肽和DA的調(diào)控有關(guān)。

葛根素；急性乙醇中毒；阿片肽；多巴胺

急性乙醇中毒是臨床常見病，患者因短時間內(nèi)攝入過量乙醇而表現(xiàn)為自控能力差、興奮、運動失調(diào)、短暫性記憶缺失、痛覺遲鈍和精神癥狀等，重者可導致昏迷或死亡?，F(xiàn)代研究［1］認為：急性乙醇中毒的系列癥狀與腦內(nèi)多種神經(jīng)遞質(zhì)的改變有關(guān)，腦內(nèi)內(nèi)源性阿片肽和多巴胺（dopamine，DA）等神經(jīng)遞質(zhì)的變化可能是導致這些癥狀產(chǎn)生的重要原因之一。目前關(guān)于乙醇中毒對腦內(nèi)阿片肽和DA影響的研究越來越深入。Jarjour等［2］研究顯示：急性乙醇攝入有促使內(nèi)源性阿片肽釋放的作用，也有學者［3－4］報道了乙醇中毒時腦內(nèi)阿片受體的變化和阿片受體拮抗劑對急性乙醇中毒的作用；研究者［5－6］通過對腦組織的電生理觀察初步證實了乙醇攝入后多巴胺能神經(jīng)元對運動興奮的重要作用，闡明了DA與乙醇中毒臨床癥狀的關(guān)系。在我國葛根用于解酒已有4千多年的歷史，中藥解酒研究中以解酒保肝研究［7］較多，葛根素對乙醇中毒所致的腦組織內(nèi)源性阿片肽和DA的調(diào)控作用尚未見系統(tǒng)研究。鑒于內(nèi)源性阿片肽和DA在腦內(nèi)分布較廣，本研究在前期關(guān)于葛根素對急性乙醇中毒腦內(nèi)氧自由基和行為學干預研究［8］的基礎(chǔ)上，通過觀察葛根素對急性乙醇中毒大鼠模型多個腦區(qū)內(nèi)源性阿片肽，即β－內(nèi) 啡 肽 （β－endorphin，β－EP）、 強 啡 肽（dynorphin，DnyA）和亮腦啡肽（Leu－enkaphalin，L－EK）及DA等水平的影響，進一步探討葛根素對乙醇中毒大鼠腦內(nèi)內(nèi)源性阿片肽及DA的調(diào)控作用，旨在降低乙醇對機體的損害，為臨床防治急性乙醇中毒和開發(fā)中藥葛根作為解酒藥物提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑 雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量為（200±20）g（山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司），動物合格證號：SCXK魯20080002。56%白酒（北京懷柔紅星股份有限公司），2%注射用葛根素（山東瑞陽制藥有限公司），β－EP、DnyA 和L－EK放射免疫試劑盒 （第二軍醫(yī)大學神經(jīng)生物學教研室），高香草酸（HVA）、3，4二羥苯乙酸（DOPAC）和DA均購于美國Sigma公司。

1.2 急性乙醇中毒大鼠模型的建立 健康雄性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，用56%白酒按15g·kg－1灌胃，于60min后將大鼠斷頭取血，采用頂針空氣色譜法（HPGC）檢測，將大鼠全血標本中乙醇濃度為1.25g·L－1作為造模成功的評價標準。

1.3 實驗分組及給藥方法 24只SD大鼠隨機分為對照組、乙醇中毒組和葛根素組，每組8只。乙醇中毒組大鼠給予56%白酒，按15g·kg－1劑量灌胃；葛根素組大鼠給予56%白酒，按15g·kg－1灌胃，同時給予葛根素200mg·kg－1腹腔注射。對照組大鼠給予與乙醇等容量的生理鹽水灌胃，對照組和乙醇中毒組大鼠用與葛根素等容量的生理鹽水腹腔注射。

1.4 大鼠腦組織內(nèi)各項指標的檢測 采用放射免疫法檢測大鼠腦組織內(nèi)阿片肽水平：給藥90min后，斷頭處死大鼠，立即取下大鼠右半腦，在沸騰的生理鹽水中煮5min，分離皮層、海馬、紋狀體和小腦，準確稱質(zhì)量后，分別置于玻璃勻漿管內(nèi)，加入1mol·L－1醋酸1mL，充分勻漿后轉(zhuǎn)入到塑料 試 管 中，室 溫 放 置 100min。4℃、4 000r·min－1離心20min，取上清加入1mol·L－1NaOH 1mL用來中和酸，按照試劑盒說明書操作方法檢測β－EP、DnyA和L－EK水平。采用高效液相色譜（HPLC）法檢測大鼠腦組織內(nèi)DA水平：給藥90min后，斷頭處死大鼠，立即取下大鼠左半腦，冰上分離皮層、海馬、紋狀體和小腦，放入1.5mL EP管中準確稱質(zhì)量，加入200μL冰冷樣品預處理A液，冰浴超聲10s（0.5Hz，振動1s，間歇1s，重復4～5次）。避光，冰浴靜置1h后，4℃、12 000r·min－1離心20min。定量吸取上清液160μL，加入半量上清液體積的樣品預處理B液（80μL），漩渦混勻。冰浴靜置1h后，4℃、12 000r·min－1離心20min。吸取上清液200μL，經(jīng)過0.22μm的一次性濾器過濾后，加樣檢測。根據(jù)HPLC結(jié)果，計算DA、DOPAC和HVA的表達水平及（DOPAC＋HVA）／DA比值。

1.5 統(tǒng)計學分析 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，β－EP、DnyA、L－EK、DA、DOPAC和HVA表達水平以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠皮層、小腦、海馬和紋狀體內(nèi)β－EP、DnyA和L－EK的表達水平 與對照組比較，乙醇中毒組大鼠皮層內(nèi)β－EP、DnyA和L－EK表達水平降低（P＜0.01），小腦、海馬和紋狀體內(nèi)β－EP、DnyA和L－EK表達水平明顯升高 （P＜0.05，P＜0.01）；與乙醇中毒組比較，葛根素組大鼠皮層內(nèi)β－EP、DnyA和 L－EK 表達水平明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），其余各腦區(qū)內(nèi)β－EP、DnyA 和L－EK表達水平均明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠腦組織內(nèi)β－EP、DnyA和L－EK的表達水平Tab.1 The expression levels ofβ－EP，Dny and L－EK in brain tissues of the rats in various groups［n＝8，±s，wB／（pg·g－1）］

表1 各組大鼠腦組織內(nèi)β－EP、DnyA和L－EK的表達水平Tab.1 The expression levels ofβ－EP，Dny and L－EK in brain tissues of the rats in various groups［n＝8，±s，wB／（pg·g－1）］

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01compared with control group；△P＜0.05，△△P＜0.01compared with alcoholism group.

06 61.75±3.64 52.01±3.86 182.79±9.62 Alcoholism 69.14±5.26＊＊ 278.19±21.63＊＊ 19.74±2.04＊＊ 78.72±5.04＊ 58.20±4.70＊＊ 218.35±32.62＊＊Puerarin 85.77±6.76＊＊△△ 299.87±14.84＊＊△ 30.34±2.72＊＊△△ 70.45±4.037△ 46.39±3.65＊△△ 193.89±14.27＊Group Hippocampus β－EP Dny A L－EK Control 113.10±12.16 326.34±15.89 23.58±2.Group Cortex β－EP DnyA L－EK Cerebellum β－EP Dny.51 497.51±17.03 132.91±6.59 580.33±26.45 Alcoholism 149.87±5.65＊＊ 836.81±31.99＊＊ 436.07±17.14＊＊ 631.91±16.82＊＊ 297.45±17.43＊＊ 730.45±22.19＊＊Puerarin 138.68±6.75＊＊△△ 763.26±22.31＊＊△△416.28±15.08＊＊△ 545.35±19.16＊＊△△ 225.53±15.50＊＊△△544.20±27.90＊A L－EK Control 118.98±6.91 590.78±17.16 270.83±10 A L－EK Striatum β－EP Dny△

2.2 大鼠腦組織皮層、小腦、海馬和紋狀體內(nèi)DA、DOPAC和HVA的表達水平 與對照組比較，乙醇中毒組大鼠皮層、小腦、海馬和紋狀體內(nèi)DA、DOPAC和 HVA表達水平升高 （P＜0.05，P＜0.01）；與乙醇中毒組比較，葛根素組大鼠小腦內(nèi)DOPAC表達水平升高 （P＞0.05），小腦內(nèi)DA、HVA及其他腦區(qū)DA、DOPAC和HVA表達水平均降低 （P＜0.05，P＜0.01）。與對照組比較，乙醇中毒性組和葛根素組大鼠各腦區(qū)（DOPAC＋HVA）／DA比值升高；與乙醇中毒組比較，葛根素組大鼠皮層、小腦、海馬內(nèi)（DOPAC＋HVA）／DA比值升高，紋狀體內(nèi)該比值降低，但差異均無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05）。見表2。

3 討 論

內(nèi)源性阿片肽是一種神經(jīng)活性物質(zhì)，廣泛存在于腦的多個部位，有激素和神經(jīng)遞質(zhì)的功能，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周器官均起作用［9］。阿片肽主要分為五大家族：腦啡肽、內(nèi)啡肽、強啡肽、孤啡肽和內(nèi)嗎啡肽，目前研究較多的是腦啡肽、內(nèi)啡肽和強啡肽。傳統(tǒng)觀點認為：阿片系統(tǒng)主要涉及到成癮物質(zhì)如酒精、嗎啡的強化和獎賞效應(yīng)。但是關(guān)于阿片類藥物成癮和脫毒的研究［10］發(fā)現(xiàn)：阿片系統(tǒng)也參與了學習記憶及運動的協(xié)調(diào)等，阿片肽含量的異?？捎绊懼袠猩窠?jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能。Davis等［11］首次提出乙醇對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害可能是通過內(nèi)源性阿片類物質(zhì)介導的這一理論，也有研究認為甲啡肽可以抑制神經(jīng)細胞生長。Sarkar等［12］通過胚胎鼠的細胞培養(yǎng)初步證實了乙醇可導致中樞β－EP神經(jīng)元凋亡；有研究［13］表明：急性乙醇攝入可以增加大腦某些區(qū)域內(nèi)啡肽和腦啡肽基因的表達，促進腦和垂體釋放內(nèi)源性阿片肽。

腦內(nèi)DA是調(diào)節(jié)軀體運動、睡眠、精神活動和精神依賴的重要神經(jīng)遞質(zhì)，DA含量異?？蓪е露喾N運動、精神系統(tǒng)疾病的產(chǎn)生。DOPAC是DA代謝的中間產(chǎn)物，而HVA則是DA代謝的終產(chǎn)物，所以， （DOPAC＋HVA）／DA可反映神經(jīng)元內(nèi)DA的代謝情況。乙醇對腦內(nèi)DA系統(tǒng)的影響可能因劑量的不同和鼠齡的不同而表現(xiàn)出不同效果。韋豐等［14］通過對成年鼠的研究發(fā)現(xiàn)：一定量的乙醇對DA系統(tǒng)有明顯的興奮作用，大腦中富含DA區(qū)域的神經(jīng)元興奮性增強，伴隨精神運動性興奮等表現(xiàn)。Shabanov等［15］發(fā)現(xiàn)：孕鼠接觸乙醇后，胎鼠腦內(nèi)DA含量減少，多巴胺能神經(jīng)系統(tǒng)活性的降低。Oswald等［13］研究發(fā)現(xiàn)：內(nèi)源性阿片系統(tǒng)對乙醇的強化與獎賞效應(yīng)可能是導致乙醇依賴和濫用的機制之一，并闡明了這種獎賞效應(yīng)與中腦多巴胺系統(tǒng)獎賞通路的密切關(guān)聯(lián)性。

表2 各組大鼠腦組織內(nèi)DA、DOPAC和HVA表達水平及（DOPAC＋HVA）／DA比值Tab.2 The expression levels of DA，DOPAC，HVA and（DOPAC＋HVA）／DA ratios in brain tissues of the rats in various groups （n＝8，±s）

表2 各組大鼠腦組織內(nèi)DA、DOPAC和HVA表達水平及（DOPAC＋HVA）／DA比值Tab.2 The expression levels of DA，DOPAC，HVA and（DOPAC＋HVA）／DA ratios in brain tissues of the rats in various groups （n＝8，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01compared with control group；△P＜0.05，△△P＜0.01compared with alcoholism group.

Group Cortex DA［wB／（ng·g－1）］DOPAC［wB／（ng·g－1）］HVA［wB／（ng·g－1）］（DOPAC＋HVA）／DA（η／%1.53±2.45 Alcoholism 16.42±1.12＊＊ 301.78±21.55＊＊ 67.10±5.03＊＊ 22.58±2.29 Puerarin 12.05±1.72△△ 225.91±22.40＊＊△△ 62.95±5.99＊＊ 24.23±2.61 Group Cerebellum DA［wB／（ng·g－1）］DOPAC［wB／（ng·g－1）］HVA［wB／（ng·g－1）］（DOPAC＋HVA）／DA（η／%））Control 13.53±1.78 147.43±16.81 5.27±0.86 1 7.39±1.15 Alcoholism 19.11±1.75＊ 224.68±28.95＊＊ 20.32±2.97＊＊ 12.95±2.13 Puerarin 18.54±2.40＊ 236.31±35.49＊＊ 19.58±2.86＊＊ 13.52±1.83 Group Hippocampus DA［wB／（ng·g－1）］DOPAC［wB／（ng·g－1）］HVA［wB／（ng·g－1）］（DOPAC＋HVA）／DA（η／%）Control 16.29±1.65 108.64±21.52 11.59±2.08 8 1.33±0.24 Alcoholism 451.39±34.46＊＊ 697.84±38.30＊＊ 17.44±1.24＊＊ 1.59±0.15 Puerarin 360.82±38.91＊＊△△ 580.63±42.42＊＊△△ 11.92±1.44＊＊△△ 1.66±0.22 Group Striatum DA［wB／（ng·g－1）］DOPAC［wB／（ng·g－1）］HVA［wB／（ng·g－1）］（DOPAC＋HVA）／DA（η／%）Control 219.53±30.07 227.32±37.28 9.94±0.9 43±37.48 1.23±0.15 Alcoholism 5 653.43±533.41＊＊ 7 237.99±351.78＊＊ 846.04±42.54＊＊ 1.44±0.11 Puerarin 5 116.74±518.69＊＊△ 6 025.01±361.73＊＊△△ 792.13±28.96＊＊△△Control 4 029.54±290.29 4 345.24±293.81 582.1.34±0.09

本研究結(jié)果顯示：與對照組比較，乙醇中毒組大鼠皮層內(nèi)β－EP、DnyA和L－EK的表達水平降低，皮層內(nèi)DA、DOPAC和HVA及小腦、海馬和紋狀體內(nèi)所有指標的表達水平均升高；與乙醇中毒組比較，葛根素組大鼠皮層內(nèi)β－EP、DnyA和L－EK的表達水平升高，DA、DOPAC和HVA表達水平降低，除小腦內(nèi)DOPAC表達水平升高外，小腦內(nèi)DA、HVA及海馬和紋狀體內(nèi)DA、DOPA和HVA的表達水平均降低，皮層、小腦和海馬內(nèi)（DOPAC＋HVA）／DA比值升高，紋狀體內(nèi)該比值降低。急性乙醇中毒后大鼠腦的多個區(qū)域阿片肽和DA表達水平升高，顯示急性乙醇中毒對大鼠腦組織有損害作用，葛根素組大鼠各腦區(qū)阿片肽和DA表達水平均降低，顯示葛根素對這2類神經(jīng)遞質(zhì)有調(diào)控作用，進而對乙醇中毒大鼠腦組織起到一定保護作用。雖然葛根素組大鼠小腦內(nèi)DOPAC的表達水平較乙醇中毒組略高，但差異無統(tǒng)計學意義。皮層、小腦和海馬中（DOPAC＋HVA）／DA比值的升高，可能是葛根素加快了DA的代謝、使其代謝產(chǎn)物DOPAC和HVA增多所致，至于紋狀體內(nèi)該比值降低的原因，還需進一步研究。

綜上所述，葛根素對乙醇中毒造成的腦損傷有一定保護作用，其機制可能與葛根素對各腦區(qū)阿片肽和DA的調(diào)控有關(guān)。

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Regulation of puerarin on endorphin and dopamine in brain of rats with acute alcoholism

CUI Shu－qin
（Department of Medical Science，Dezhou University，Dezhou 253023，China）

Objective To investigate the regulation of puerarin on the expression levels of endorphin and dopamine（DA）of cortex，cerebellum，hippocampus，and striatum of the rats with acute alcoholism and to provide basis for clinical treatment of alcoholism and the exploitation of traditional Chinese herb pueraria.Methods 24male SD rats were randomly divided into control group，alcoholism group and puerarin group，and there were 8rats in each group.The expression levels ofβ－endorphin（β－EP），dynorphin（DnyA）and Leu－enkephalin（L－EK）in cortex，cerebellum，hippocampus and striatum were detected by radioimmunoassay，and the expression levels of DA，dihydroxy－phenyl acetic acid（DOPAC）and homovanillic acid（HVA）of the rats in various groups were detected by high performance liquid chromatography（HPLC）method.The ratio of（DOPAC＋HVA）／DA was calculated.Results Compared with control group，the exrpession levels ofβ－EP，DnyA and L－EK in cortex of the rats in alcoholism group and puerarin group were decreased（P＜0.01）.The expression levels of DA，DOPAC and HVA in various brain regions were increased（P＜0.01）.Compared with alcoholism group，and the expression levels of β－EP，DnyA and L－EK in rat cortex in puerarin group were increased（P＜0.05，P＜0.01），and the expression levels of DA（P＜0.01），DOPAC（P＜0.01）and HVA in cortex and all the indexes mentioned above in the cerebellum，hippocampus and striatum were decreased（P＜0.05，P＜0.01），and the ratios of（DOPAC＋HVA）／DA in cortex，cerebellum and hippocampus were increased，but it was decreased in striatum（P＞0.05）.Conclusion Puerarin has protective effect on rat brain damage induced by acute alcoholism and the mechanism may be related to the regulation of puerarin on endorphin and DA on the rat brain.

puerarin；acute alcoholism；endorphin；dopamine

R322.8

A

1671－587Ⅹ（2013）03－0539－05

10.7694／jldxyxb20130324

2012－09－07

山東省科技廳自然科學基金資助課題 （ZR2010CL018）；山東省德州市科技局科技計劃基金資助課題（20090162－4）

崔淑芹 （1965－），女，山東省德州市人，副教授，醫(yī)學碩士，主要從事神經(jīng)生理學研究。