王海濤，劉 昊，徐愛(ài)軍，劉繼剛

（1.河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，河北 唐山 063000；2.河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 唐山 063000；3.河北省遵化市人民醫(yī)院口腔科，河北 遵化 064200）

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙大鼠海馬和杏仁核中神經(jīng)元凋亡及Caspase－9的表達(dá)及其意義

王海濤1，劉 昊2，徐愛(ài)軍1，劉繼剛3

（1.河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，河北 唐山 063000；2.河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 唐山 063000；3.河北省遵化市人民醫(yī)院口腔科，河北 遵化 064200）

目的：探討創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（PTSD）大鼠海馬和杏仁核神經(jīng)元凋亡及Caspase－9表達(dá)水平的變化，闡明PTSD大鼠海馬與杏仁核體積異常的原因。方法：將100只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（20只）和PTSD組（80只），利用改良的單一連續(xù)應(yīng)激（SPS＆S）制作PTSD大鼠模型。采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)和僵立行為實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠行為學(xué)表現(xiàn)；TUNEL方法檢測(cè)大鼠海馬和杏仁核神經(jīng)元凋亡陽(yáng)性細(xì)胞率；流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)大鼠海馬和杏仁核神經(jīng)元凋亡率；Western blotting法檢測(cè)大鼠海馬和杏仁核中Caspase－9表達(dá)水平。結(jié)果：PTSD組大鼠逃避潛伏期（EL）和僵立行為百分比顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；PTSD后1、4、7和14d大鼠海馬和杏仁核TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞和凋亡率高于對(duì)照組（P＜0.05），28d與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；PTSD后1、4、7和14d大鼠海馬和杏仁核Caspase－9表達(dá)水平高于對(duì)照組（P＜0.05），28d與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：PTSD大鼠海馬和杏仁核神經(jīng)元凋亡增加，Caspase－9表達(dá)水平上調(diào)，提示其凋亡可能是引起海馬與杏仁核體積異常的原因之一。

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙；海馬；杏仁核；細(xì)胞凋亡

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（posttraumatic stress disorder，PTSD）是對(duì)創(chuàng)傷等嚴(yán)重應(yīng)激因素的一種異常精神反應(yīng)，由異常威脅性或?yàn)?zāi)難性心理創(chuàng)傷而引起，核心癥狀為闖入性創(chuàng)傷再體驗(yàn)、警覺(jué)性增高和反應(yīng)麻木。PTSD發(fā)病率高、病程長(zhǎng)、療效差，成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一［1－2］，但其詳細(xì)發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。在應(yīng)激性疾病發(fā)病過(guò)程中，海馬、杏仁核等邊緣系統(tǒng)具有重要作用。研究［3－4］表明：PTSD患者腦部海馬和杏仁核存在結(jié)構(gòu)萎縮、體積縮小現(xiàn)象。國(guó)內(nèi)學(xué)者［5－6］利用單一連續(xù)應(yīng)激（single prolonged stress，SPS）復(fù)制PTSD模型，從形態(tài)學(xué)方面探討其原因的結(jié)果提示：PTSD海馬和杏仁核部位可見(jiàn)具有凋亡特征的神經(jīng)元。但尚未見(jiàn)PTSD海馬、杏仁核神經(jīng)元凋亡發(fā)生規(guī)律及其調(diào)控的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)建立PTSD大鼠模型，檢測(cè)大鼠海馬和杏仁核神經(jīng)元凋亡發(fā)生規(guī)律，以揭示海馬和杏仁核結(jié)構(gòu)異常的原因，為PTSD發(fā)病機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性Wistar大鼠100只，體質(zhì)量180～200g（河北聯(lián)合大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證編號(hào)：SCXK京2009－0004）。實(shí)驗(yàn)前大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。飼養(yǎng)條件：22℃～25℃，晝夜節(jié)律（12／12h），自由飲水?dāng)z食。

1.2 主要試劑和儀器

原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（Roch公司），兔抗鼠Caspase－9一抗（美國(guó)Santa Cruz公司），辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG（博士德生物技術(shù)公司）；流式細(xì)胞儀（FACSCalibur，美國(guó)B＆D公司），Morris水迷宮（淮北正華公司）。

1.3 PTSD模型建立及動(dòng)物分組

將大鼠分為對(duì)照組（20只）和PTSD組（80只）。采用改良的SPS制作PTSD動(dòng)物模型。具體方法：首先給予大鼠SPS，包括禁錮2h、強(qiáng)迫游泳15min和乙醚麻醉至昏迷；隨后給予不可逃避足底電擊（single inescapable electric foot shock），電擊后靜養(yǎng)7d。PTSD組大鼠分別于靜養(yǎng)結(jié)束后1、4、7、14和28d處死，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死5只大鼠，行TUNE法、流式細(xì)胞術(shù)和Western blotting法檢測(cè)，共處死75只大鼠。對(duì)照組大鼠每天抓取1次，無(wú)其他額外刺激。

1.4 大鼠行為學(xué)檢測(cè)

對(duì)照組和PTSD組各取5只大鼠用于行為學(xué)檢測(cè)。

1.4.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 連續(xù)測(cè)試3d，每天5個(gè)循環(huán)，記錄大鼠在120s內(nèi)尋找水面下平臺(tái)的時(shí)間，即逃避潛伏期（escape latency，EL）。取3d的平均測(cè)試結(jié)果。

1.4.2 僵立行為測(cè)定 2組大鼠于電擊后7d，放入電擊設(shè)備箱內(nèi)，檢測(cè)大鼠4min僵立行為。每10s測(cè)1次，表現(xiàn)為僵立行為判定為陽(yáng)性，所得陽(yáng)性次數(shù)之和占總次數(shù)的百分比為僵立行為百分比。

1.5 TUNEL法檢測(cè)大鼠海馬和杏仁核神經(jīng)元凋亡陽(yáng)性率

對(duì)照組和PTSD組各時(shí)間點(diǎn)分別取5只大鼠，麻醉后斷頭取腦，常規(guī)石蠟包埋，做石蠟切片（5μm）。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行TUNEL染色，檢測(cè)海馬和杏仁核神經(jīng)元凋亡。每張切片分別隨機(jī)取5個(gè)高倍鏡視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算凋亡陽(yáng)性細(xì)胞率。陽(yáng)性細(xì)胞率＝（TUNEL陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)／視野內(nèi)神經(jīng)元總數(shù)）×100%。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大鼠海馬和杏仁核神經(jīng)元凋亡率

對(duì)照組和PTSD組各時(shí)間點(diǎn)分別取5只大鼠，麻醉后斷頭取腦，分離海馬和杏仁核。將海馬和杏仁核組織用0.25%胰酶37℃恒溫消化為細(xì)胞懸液。經(jīng)過(guò)濾純化，用PBS調(diào)整細(xì)胞濃度為（5～10）×105mL－1。取1mL細(xì)胞，1 000r·min－1、4℃離心10min，棄上清，加入1mL預(yù)冷PBS，振蕩使細(xì)胞懸浮。重復(fù)操作3次，棄上清。將細(xì)胞重懸于200μL Binding Buffer液中，加入10μL Annexin V－FITC和5μL Propidium Iodide，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15min。加入300μL Binding Buffer液，上機(jī)檢測(cè)。計(jì)算早期凋亡細(xì)胞占存活細(xì)胞的比例，即神經(jīng)元凋亡率。

1.7 Western blotting法檢測(cè)Caspase－9表達(dá)水平

對(duì)照組和PTSD組各時(shí)間點(diǎn)分別取5只大鼠，麻醉后斷頭取腦，冰上快速分離海馬和杏仁核，加入RIPA裂解液，提取組織總蛋白，定量后按照30μg蛋白量上樣，進(jìn)行10%SDS－PAGE電泳，PVDF膜電轉(zhuǎn)印，脫脂奶粉封閉，Caspase－9一抗（1∶500）4℃孵育過(guò)夜，二抗IgG（1∶5 000）室溫孵育1h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯色。內(nèi)參照β－actin的 Westen blotting分析方法同上。以目的條帶與內(nèi)參照的光密度比值表示蛋白表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。大鼠平均EL、僵立行為百分比、TUNEL陽(yáng)性率、神經(jīng)元凋亡率和Caspase－9表達(dá)水平以±s表示。大鼠平均EL、僵立百分比組間比較采用t檢驗(yàn)，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞率、神經(jīng)元凋亡率和Caspase－9表達(dá)水平組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 2組大鼠平均EL

對(duì)照組與PTSD組大鼠平均EL分別為（15.63±1.09）s和（72.76±5.84）s，PTSD組顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。Morris水迷宮軌跡圖見(jiàn)圖1。

2.2 2組大鼠僵立行為百分比

PTSD組大鼠再次放入電擊設(shè)備箱后（重新面臨恐懼情景時(shí)），大鼠表現(xiàn)為明顯的僵立行為，活動(dòng)明顯減少，主要為刻板的蹲伏行為，僅頭部有輕微的轉(zhuǎn)動(dòng)，背部拱起。對(duì)照組大鼠表現(xiàn)為自由運(yùn)動(dòng)。對(duì)照組大鼠僵立行為百分比為（12.5±4.2）%，PTSD組大鼠為（60.0±7.6）%，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)軌跡圖Fig.1 The locus result of Morris water maze test

2.3 2組大鼠海馬和杏仁核神經(jīng)元凋亡

鏡下可見(jiàn)：對(duì)照組大鼠TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞較少，凋亡率低，PTSD組各時(shí)間點(diǎn)陽(yáng)性細(xì)胞率明顯上調(diào)。與對(duì)照組比較，PTSD后1d大鼠海馬和杏仁核組織凋亡細(xì)胞明顯增多，凋亡率增高，4d繼續(xù)增多，7d達(dá)到高峰，14d開(kāi)始下降，但仍明顯高于對(duì)照組 （P＜0.05）。PTSD后28d，陽(yáng)性細(xì)胞率和凋亡率與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠海馬和杏仁核神經(jīng)元凋亡Tab.1 Neuronal apoptosis in rat hippocampus and amydala in various groups ［η／（±s）%）］

表1 各組大鼠海馬和杏仁核神經(jīng)元凋亡Tab.1 Neuronal apoptosis in rat hippocampus and amydala in various groups ［η／（±s）%）］

＊P＜0.05compared with control group.

Group n TUNEL－positive cell rate Hippocampus Amyg 8±0.17 PTSD 80 1d 8.55±1.06＊ 10.78±1.41＊ 5.35±0.47＊ 5.42±0.89＊4d 18.61±1.80＊ 15.53±2.03＊ 18.61±1.80＊ 10.21±0.75＊7d 31.07±3.64＊ 25.51±2.20＊ 25.50±2.20＊ 18.24±1.82＊14d 18.27±1.79＊ 10.21±0.79＊ 10.21±0.79＊ 12.71±1.65＊Apop dala Control 20 5.16±0.84 3.04±0.48 2.55±0.79 2.3 dala totic rate Hippocampus Amyg 28d 6.70±0.82 4.89±0.85 4.89±0.85 1.61±0.28

2.4 大鼠海馬和杏仁核Caspase－9表達(dá)水平

與對(duì)照組比較，PTSD后1、4、7和14d大鼠海馬和杏仁核Caspase－9蛋白表達(dá)水平均明顯增高 （均P＜0.05）。PTSD后28dCaspase－9蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。見(jiàn)圖2和表2。

圖2 大鼠海馬和杏仁核Caspase－9的表達(dá)電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of Caspase－9in hiappocampus and amygdala of rats

表2 2組大鼠海馬和杏仁核Caspase－9表達(dá)水平Tab.2 The expression levels of Caspase－9in hippocampus and amygdala of rats in two groups （±s）

表2 2組大鼠海馬和杏仁核Caspase－9表達(dá)水平Tab.2 The expression levels of Caspase－9in hippocampus and amygdala of rats in two groups （±s）

＊P＜0.05compared with control group.

Group n Expression levels of Caspase－9 Hippocampus Amygdala Control 20 0.43±0.04 0.43±0.02 PTSD 80 1d 15 0.66±0.07＊ 0.68±0.03＊4d 15 1.00±0.11＊ 0.98±0.13＊7d 15 1.23±0.10＊ 1.18±0.08＊14d 15 1.09±0.12＊ 1.05±0.08＊28d 15 0.57±0.10 0.59±0.09

3 討 論

PTSD是由異常威脅性或?yàn)?zāi)難性心理創(chuàng)傷而導(dǎo)致的延遲出現(xiàn)持續(xù)的精神障礙，是對(duì)創(chuàng)傷等嚴(yán)重刺激因素的一種異常精神反應(yīng)，是應(yīng)激疾病中最為典型的一種。隨著戰(zhàn)爭(zhēng)、社會(huì)暴力事件、重大交通事故和自然災(zāi)害等創(chuàng)傷意外事件不斷增多，PTSD發(fā)生率越來(lái)越高，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量和社會(huì)穩(wěn)定。對(duì)PTSD的基礎(chǔ)研究得益于動(dòng)物模型的建立。研究［7］表明：在大鼠接受SPS后立即給予不可逃避的足底電擊，能使大鼠表現(xiàn)出PTSD臨床癥狀，是研究PTSD較好的動(dòng)物模型。本研究行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示：PTSD組大鼠尋找平臺(tái)的逃避潛伏期顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明SPS＆S應(yīng)激能損傷大鼠的空間記憶能力?？植烙洃浶袨闇y(cè)定結(jié)果顯示：模型組僵立行為百分比顯著高于對(duì)照組，表明SPS＆S可使大鼠獲得對(duì)恐懼情景的記憶，上述結(jié)果表明該模型較好地模擬了PTSD的核心癥狀即病理性恐懼記憶增強(qiáng)。

PTSD詳細(xì)發(fā)病機(jī)制目前尚未被闡明。在嚴(yán)重創(chuàng)傷應(yīng)激急性期，中樞神經(jīng)系統(tǒng)皮質(zhì)邊緣區(qū)，特別是大鼠海馬和杏仁核等部位是中樞神經(jīng)系統(tǒng)應(yīng)激應(yīng)答敏感區(qū)，其功能正常與否與PTSD發(fā)病密切相關(guān)。海馬是學(xué)習(xí)記憶的重要腦區(qū)，杏仁核是恐懼形成和表達(dá)的關(guān)鍵中樞，杏仁基底外側(cè)核和中央核被認(rèn)為是恐懼學(xué)習(xí)和記憶中重要的中樞，在介導(dǎo)應(yīng)激相關(guān)的記憶損害尤其是闖入性記憶中起重要作用［8］，而且海馬和杏仁核的功能密切相關(guān)，海馬的部分功能可由杏仁核的調(diào)節(jié)而實(shí)現(xiàn)［9］。PTSD患者和動(dòng)物模型均發(fā)現(xiàn)腦部海馬和杏仁核存在結(jié)構(gòu)萎縮、體積縮小現(xiàn)象［3－4］。上述研究結(jié)果提示：在PTSD發(fā)病過(guò)程中，海馬和杏仁核部位神經(jīng)元存在丟失或死亡等病理改變。細(xì)胞凋亡為細(xì)胞程序性死亡，是細(xì)胞為維持內(nèi)部環(huán)境穩(wěn)定，由基因活動(dòng)指導(dǎo)下的主動(dòng)性死亡。國(guó)內(nèi)學(xué)者［10－12］采用SPS應(yīng)激復(fù)制PTSD大鼠模型時(shí)發(fā)現(xiàn)：大鼠海馬和杏仁核部位存在神經(jīng)元凋亡現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：SPS＆S應(yīng)激后大鼠海馬和杏仁核存在明顯的細(xì)胞凋亡，提示神經(jīng)元凋亡可能與PTSD大鼠海馬、杏仁核體積異常有關(guān)。Caspase家族是凋亡的主要執(zhí)行者，其中Caspase－9與凋亡啟動(dòng)有關(guān)。本研究中Caspase－9在PTSD大鼠海馬和杏仁核組織中表達(dá)上調(diào)，提示Caspase－9可能是PTSD記憶減退、警覺(jué)增高和恐懼異常形成的病理生理基礎(chǔ)之一。

綜上所述，PTSD大鼠海馬和杏仁核存在細(xì)胞凋亡，但這些部位神經(jīng)元凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制以及PTSD的詳細(xì)發(fā)病機(jī)制尚需進(jìn)一步研究探討。

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Neuronal apoptosis and expressions of Caspase－9in hippocampus and amygdala of PTSD rats and their significances

WANG Hai－tao1，LIU Hao2，XU Ai－jun1，LIU Ji－gang3
（1.Department of Histology and Embryology，College of Basic Medicine，Hebei United University，Tangshan 063000，China；2.Department of Neurology，Affiliated Hospital，Hebei United University，Tangshan 063000，China；3.Department of Stomatology，Zunhua People’s Hospital，Hebei Province，Zunhua 064200，China）

Objective To observe the changes of neuronal apoptosis and expression levels of Caspase－9in hippocampus and amygdala of posttraumatic stress disorder（PTSD）rats，and to disscus the mechanism of the volume abnormalities of hippocampus and amygdala.Methods 100male Wistar rats were divided into control group（n＝20）and PTSD group（n＝80）.The PTSD rat model was produced by giving the rats single－prolonged stress followed a single inescapable electric foot shock（SPS ＆ S）.The behavior changes of rats were examined using Morris water maze test and freezing behavior test.The positive apoptotic rates of cells and apoptotic rates in hippocampus and amygdala were detected by TUNEL－staining and flow cytometry（FCM）.The expression level of Caspase－9was detected by Western blotting method.Results The excape latency （EL）time and percentage of freezing behavior in PTSD group were higher than those in control group（P＜0.05）.The percentages of TUNEL－positive cells and the apoptotic rates in hippocampus and amygdala of PTSD 1，4，7and 14drats were higher than those in control group（P＜0.05），but there was no significant difference between PTSD 28drats and control rats（P＞0.05）.The expression levels of Caspase－9in hippocampus and amygdala of PTSD 1，4，7and 14drats were higher than those in control group（P＜0.05）.Conclusion The apoptosis of neurons and expression levels of Caspase－9in hippocampus and amygdala of PTSD rats are increased，which indicates that apoptosis may be duced to the volume abnormalities of hippocampus and amygdala of PTSD.

posttraumatic stress disorder；hippocampus；amygdala；apoptosis

R322.81

A

1671－587Ⅹ（2013）03－0427－05

10.7694／jldxyxb20130301

2012－10－31

國(guó)家自然科學(xué)基金資助課題 （81201048）；河北省自然科學(xué)基金資助課題 （H2012401009）

王海濤 （1972－），男，山東省鄆城縣人，副教授，醫(yī)學(xué)博士，主要從事應(yīng)激性疾病方面的研究。

王海濤 （Tel：0315－3725754，E－mail：wht92725＠163.com）

時(shí)間：2013－04－23 18：40

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／22.1342.R.20130423.1840.002.html