張 朋，曹 緯，周初松，呂 海，蔡進(jìn)奎，陳 仲

腰椎椎間盤退變突出是脊柱外科常見疾病，通過制備具有天然三維結(jié)構(gòu)的髓核基質(zhì)支架來構(gòu)建組織工程化髓核，可能有助于改變目前主要通過摘除髓核并內(nèi)固定手術(shù)治療的模式［1-3］。到目前為止，髓核組織工程支架材料在物理性能、生物性能與正常髓核相比仍有較大的差距，尚無與髓核結(jié)構(gòu)高度相似且理化性能相近的支架材料。為此，本實(shí)驗(yàn)試圖研究機(jī)械振蕩及去污劑濃度對(duì)髓核脫細(xì)胞程度及其基質(zhì)形態(tài)學(xué)變化的影響［4］，探討制備髓核去細(xì)胞支架的方法，為構(gòu)建具有天然髓核基質(zhì)結(jié)構(gòu)的組織工程化髓核提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和器材

新西蘭兔(南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，Triton X-100(Amresco)，PBS 緩沖液、HE 染色試劑、脫氧膽酸鈉［羅基(北京)生物技術(shù)有限公司］，恒溫回旋振蕩器(南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室)，掃描電鏡(南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室)。

1.2 兔髓核的來源

健康成年兔，雌雄不限，重2～3 kg。采用空氣栓塞的方法將兔處死。然后行兔后背正中切口暴露并游離相應(yīng)椎間盤、取出髓核。每段長約0.5 cm，分為7 個(gè)組，每組5 塊，行脫細(xì)胞處理或作為空白對(duì)照，其中2 塊用于石蠟切片，2 塊用于掃描電鏡觀察。

1.3 髓核的預(yù)處理和化學(xué)萃取

先在手術(shù)顯微鏡下去除非髓核組織，然后進(jìn)行萃取處理。A、B、C、D 4 組的萃取振蕩頻率分別0、80、130、180 r/min，C1、C2、C3 組的去污劑濃度分別為1%、3%、5%，其余各組的濃度均為3%。E 組為對(duì)照組，不作處理。萃取步驟:①浸入去離子水中浸泡12 h［5］;②將髓核分別放入相應(yīng)濃度Triton X-100 的PBS 溶液中。室溫振蕩萃取12 h;③用PBS 溶液漂洗3 次，每次45 min，并用去離子水漂洗2 次，每次1 h;④放入相應(yīng)濃度的脫氧膽酸鈉PBS 溶液中室溫振蕩萃取24 h［5］;⑤PBS 溶液漂洗3 次，每次45 min，并用去離子水漂洗2 次，每次1 h;⑥重復(fù)1～5 操作步驟1次;⑦萃取后的髓核置4℃無菌PBS 溶液(PH 7.4，無鈣鎂)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 觀察

大體觀察:觀察各組標(biāo)本的外形、色澤、透明度等情況。

HE 染色:用10%的福爾馬林溶液固定，切片后行HE 染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察髓核內(nèi)細(xì)胞清除是否完全及基質(zhì)纖維的結(jié)構(gòu)變化。

掃描電鏡:觀察采用25 g/L 的戊二醛和鋨酸固定。經(jīng)干燥和表面噴金后貼片行掃描電鏡觀察。

2 結(jié) 果

2.1 去細(xì)胞髓核支架的大體觀察

肉眼觀，新鮮兔髓核(E 組)柔軟，半透明，成膠凍狀，形態(tài)不固定。經(jīng)去離子水浸泡1 h 后，明顯腫脹;浸泡中的髓核外圍部分可見明顯細(xì)絲狀突出，呈絮狀物，透明程度明顯增加(見圖1a，b)。A 組、B組、C1 組經(jīng)去污劑萃取后，去細(xì)胞髓核在無離子水中呈絮狀物，外圍帶少量灰白色絲狀突出;取出后呈半透明狀，體積較新鮮髓核(E 組)組織稍變小(見圖1c～e)。C2 組經(jīng)去污劑萃取后，去細(xì)胞采集在無離子水中呈絮狀物，外圍帶有多量灰白色絲狀突出，絲狀物直徑變小、變扁;髓核取出后呈半透明狀(見圖1f)。C3 組與D 組去細(xì)胞髓核明顯破損，絲狀物斷裂、脫落，更加不規(guī)則;取出后髓核的透明程度增加，但與新鮮髓核(E 組)相比，形態(tài)散亂、總體積變小(見圖1g，h)。

2.2 去細(xì)胞髓核支架的顯微結(jié)構(gòu)觀察

2.2.1 HE 染色切片觀察

圖1 髓核去細(xì)胞支架大體觀察Fig.1 Microscopic appearance of the accellular nucleus pulposus scaffold

新鮮髓核(E 組)層次分明，結(jié)構(gòu)緊密，整個(gè)髓核視野內(nèi)均可見大量細(xì)胞結(jié)構(gòu)，細(xì)胞邊界清楚，胞漿和周圍的纖維結(jié)締組織紅染。結(jié)締組織彼此交聯(lián)，境界清晰、銳利，呈均勻分布的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(見圖2a)。髓核經(jīng)去污劑萃取后，著色較淡，A、B、C、D 各組的髓核內(nèi)的細(xì)胞基本清除或者殘存部分脫核細(xì)胞殘株，可見大量無細(xì)胞核的“空泡狀”結(jié)構(gòu)。A 組、B 組和C1 組髓核內(nèi)細(xì)胞清除不完全，可見較多胞漿紅染的脫核的細(xì)胞殘株，可見大量成束分布的基質(zhì)纖維，形態(tài)不規(guī)則，彼此交織成網(wǎng)狀，可見數(shù)個(gè)藍(lán)染的核物質(zhì)顆粒(見圖2b～d);C2 組髓核內(nèi)細(xì)胞清除非常完全，層次結(jié)構(gòu)消失，未見細(xì)胞結(jié)構(gòu)殘留及藍(lán)染核物質(zhì)顆粒，僅可見網(wǎng)狀排列的淡紅色基質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)(見圖2e);C3 組和D 組與C2 組鏡下觀相似，但髓核外基質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)紊亂，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不清晰，有較明顯損害(見圖2f，g)。

2.2.2 掃描電鏡觀察

正常髓核組織(E 組)可見大量髓核細(xì)胞，形態(tài)為圓形或者橢圓形(見圖3a);細(xì)胞外基質(zhì)纖維清晰可見，排列成交織的三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(見圖3b)。A 組、B 組及C1 組去細(xì)胞髓核內(nèi)基質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)清晰，呈網(wǎng)狀排列的細(xì)胞外基質(zhì)纖維間殘存大量脫核的細(xì)胞殘株碎片(見圖3c～e)。C2 組經(jīng)去污劑萃取后，髓核內(nèi)細(xì)胞幾乎完全消失，視野內(nèi)由網(wǎng)狀排列的細(xì)胞外基質(zhì)纖維構(gòu)成，可見基質(zhì)纖維呈縱行、橫行交織排列成網(wǎng)格狀(見圖3f)。C3 組和D 組脫細(xì)胞髓核內(nèi)未見細(xì)胞結(jié)構(gòu)，細(xì)胞外基質(zhì)纖維亦呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，但是結(jié)構(gòu)紊亂，其三維空間結(jié)構(gòu)塌陷，其纖維條的直徑未見明顯變化，但可見較多的基質(zhì)纖維扭曲和斷裂(見圖3g，h)。

3 討 論

以支架材料進(jìn)行動(dòng)物椎間盤退變(以髓核組織為主)修復(fù)的報(bào)道較多，但治療或者逆轉(zhuǎn)椎間盤退變的療效尚未獲得實(shí)質(zhì)性的突破，其中原因之一可能是缺乏天然的與髓核細(xì)胞生長環(huán)境高度一致的支架材料，影響了髓核細(xì)胞的增殖、分化進(jìn)程［6］。理想的去細(xì)胞髓核支架應(yīng)保留天然的髓核基質(zhì)纖維骨架，且去除細(xì)胞等主要抗原成分，消除引起免疫反應(yīng)的主要因素，為植入細(xì)胞的存活、增殖、分化提供良好的細(xì)胞微環(huán)境。近年來，有關(guān)新的理化方法制備脫細(xì)胞基質(zhì)材料以及除垢工藝的進(jìn)展，為進(jìn)一步提高脫細(xì)胞基質(zhì)材料的制備工藝及質(zhì)量提供了新的思路。國內(nèi)已有非髓核組織脫細(xì)胞方法的研究報(bào)道，本研究運(yùn)用文獻(xiàn)［7-8］所用脫細(xì)胞方法，并加以改進(jìn)，采用Triton X-100 和脫氧膽酸鈉聯(lián)合脫細(xì)胞。Triton X-100 屬于非離子型表面活性劑，在溶液中穩(wěn)定性高，能與生物膜中的磷脂等脂質(zhì)結(jié)合形成可溶性復(fù)合物。Triton X-100 中的疏水端也能和膜蛋白的疏水區(qū)結(jié)合形成復(fù)合物，溶解于溶液中。因此Triton X-100 能徹底破壞生物膜，從而使細(xì)胞溶解破壞，使細(xì)胞內(nèi)的成分充分釋放出來，達(dá)到去除髓核細(xì)胞成份的目的。脫氧膽酸鈉為陰離子去垢劑，即陰離子型表面活性劑，是一種效力較強(qiáng)的化學(xué)消化劑，可進(jìn)一步破壞細(xì)胞，并消化降解細(xì)胞碎片。非離子型去污劑在保存外基質(zhì)方面效果較好，陰離子型和陽離子型去污劑在去除細(xì)胞方面效果較好。為此，本實(shí)驗(yàn)在前人去污劑萃取方法的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，觀察在不同的機(jī)械振蕩頻率及不同去污劑濃度的作用下，髓核去細(xì)胞程度及其基質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞程度，探討髓核去細(xì)胞支架的制備方法［9-10］。

圖2 髓核去細(xì)胞支架石蠟切片(HE 染色，×20)Fig.2 Microscopic appearance of the accellular nucleus pulposus scaffold (HE staining，×20)

圖3 髓核去細(xì)胞支架的掃描電鏡圖(b-h×10 000，a×5 000)Fig.3 Morphology of the acellular nucleus pulposus observed by acsnning electron microscope (b-h×10 000，a×5 000)

本實(shí)驗(yàn)是在去離子水浸泡、給予低滲環(huán)境輕度破壞髓核細(xì)胞的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)使用不同濃度的Triton X-100與脫氧膽酸鈉在不同震蕩頻率條件下聯(lián)合脫細(xì)胞，發(fā)揮兩者高效脫細(xì)胞的優(yōu)勢，增加脫細(xì)胞的效率，對(duì)處理后的支架材料做大體觀察、掃描電鏡、組織學(xué)觀察，探索去污劑法最佳的適合髓核脫細(xì)胞方案。研究表明，應(yīng)用體積分?jǐn)?shù)為3% Triton X-100與3%的脫氧膽酸鈉在130 r/min 的轉(zhuǎn)速條件下，可以將髓核細(xì)胞較徹底清除，且較完好地保留髓核組織的天然網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

化學(xué)萃取制備髓核去細(xì)胞支架的原則主要去除細(xì)胞等主要抗原物質(zhì)的同時(shí)，盡可能保留基質(zhì)的三維空間結(jié)構(gòu)。目前尚未見用去污劑對(duì)髓核組織進(jìn)行脫細(xì)胞制備天然支架的相關(guān)報(bào)道。Sondell 等［4］用Triton X-100和脫氧膽酸鈉成功制備大鼠坐骨神經(jīng)去細(xì)胞支架，清除了神經(jīng)組織內(nèi)所有細(xì)胞成分，保留了細(xì)胞外基質(zhì)支架成分。

使用去污劑制備去細(xì)胞支架的效果主要取決于選擇合適的去污劑，此外，去污劑濃度、萃取溫度、時(shí)間以及機(jī)械振蕩也是影響去細(xì)胞效果的因素。本實(shí)驗(yàn)組借鑒Sondell 等［4］的化學(xué)萃取法并加以改進(jìn)，且附加了不同頻率的機(jī)械振動(dòng)以及不同濃度的去污劑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在去污劑體積分?jǐn)?shù)為3%的條件下，當(dāng)機(jī)械振動(dòng)頻率為0 或者80 r/min 時(shí)，經(jīng)脫細(xì)胞處理的支架中仍有大量細(xì)胞或者細(xì)胞沉淀物殘留。當(dāng)機(jī)械振蕩頻率為130r/min 時(shí)，髓核內(nèi)細(xì)胞成分清除徹底，且支架的外基質(zhì)成分形態(tài)在大體及鏡下皆保持良好，無明顯損毀。但是振動(dòng)頻率增大為180r/min 時(shí)，髓核內(nèi)細(xì)胞雖然清除徹底，但髓核已明顯破損，鏡下可見基質(zhì)纖維排列紊亂，出現(xiàn)明顯的斷裂，基質(zhì)纖維的三維空間存在較嚴(yán)重的破壞。由此得出:①在無機(jī)械振蕩或振蕩頻率比較低時(shí)，髓核細(xì)胞可以被清除，但是清除率有限;②在一定頻率范圍內(nèi)，適宜的機(jī)械振蕩頻率可以促進(jìn)髓核內(nèi)細(xì)胞成分的清除，這可能與髓核組織結(jié)構(gòu)疏松、細(xì)胞間連結(jié)松散有直接關(guān)系，而且去污劑在髓核組織中擴(kuò)散，利于其發(fā)揮脫細(xì)胞作用，但過強(qiáng)的振動(dòng)頻率則會(huì)對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)造成一定破壞［11］;③適當(dāng)?shù)娜ノ蹌舛燃扔欣谒韬思?xì)胞的清除，同時(shí)也不會(huì)對(duì)基質(zhì)的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)造成破壞;但是濃度過低髓核細(xì)胞清除不徹底，濃度過高則同樣會(huì)對(duì)髓核外基質(zhì)三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)造成破壞。

綜上所述，去污劑的濃度及機(jī)械震蕩是影響髓核去細(xì)胞支架制備效果的重要因素，適當(dāng)?shù)臋C(jī)械震蕩頻率以及合理的去污劑濃度有利于徹底去除髓核細(xì)胞等抗原成分，且有利于保存髓核外基質(zhì)的三維基質(zhì)結(jié)構(gòu)，為植入細(xì)胞的存活、增殖、分化以及細(xì)胞外基質(zhì)的再生提供高度仿生的三維空間微環(huán)境。為構(gòu)建理想的組織工程化髓核仍需進(jìn)一步進(jìn)行免疫組織相容性［12-13］等方面的研究。

［1］Liu C，Xia Z，Czernuszka JT.Design and development of threedimensional scaffolds for tissue engineering［J］.Chem Eng Resand Des，2007，85(A7):1051-1064.

［2］Chadderdon RC，Shimer AL，Gilbertson LG，et al.Advances in gene therapy for intervertebral disc degeneration［J］.Spine J，2004，4(6 Suppl):341-347.

［3］Nomura T，Mochida J，Okuma M，et al.Nucleus pulposus allograft retards intervertebral disc degeneration［J］.Clin Orthop Relat Res，2001(389):94-101.

［4］Scondell M，Lundborg G，Kanje M.Regeneration of the rat sciatic nerve into allografts made acellular through chemical extraction［J］.Brain Res，1998，795(1-2):44-54.

［5］李康杰，孫抒.去除移植免疫反應(yīng)抗原成分脫細(xì)胞天然骨基質(zhì)的制備［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15(8):1355-1359.

［6］Sell S，Barnes C，Smith M，et al.Extracellular matrix regenerated:tissue engineering via electrospun biomimetic nanofibers［J］.Polym Int，2007，56(11):1349-1360.

［7］Hudson TW，Liu SY，Schmidt CE.Engineering an improved acellular nerve graft via optimized chemical processing［J］.Tissue Eng，2004，10(9-10):1346-1358.

［8］Hudson TW，Zawko S，Deister C，et al.Optimized acellular nerve graft is immunologically tolerated and supports regeneration［J］.Tissue Eng，2004，10(11-12):1641-1651.

［9］Falke G，Yoo JJ，Kwon TG，et al.Formation of corporal tissue architecture in vivo using human cavernosal muscle and endothelial cells seeded on collagen matrices［J］.Tissue Eng，2003，9(5):871-879.

［10］Freytes DO，Badylak SF，Webster TJ，et al.Biaxial strength of multilaminated extracellular matrix scaffolds［J］.Biomaterials，2004，25(12):2353-2361.

［11］Yin WH，Jin DD，Deng XY，et al.Effects of mechanical vibration on the morphology of the acellular scaffold for the spinal cord［J］.Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao，2008，28(10):1748-1751.

［12］許國華，葉曉健，袁文，等.納米氧化鋯磷酸鈣骨支架體內(nèi)免疫及相容性研究［J］.脊柱外科雜志，2007，5(5):302-304.

［13］呂宏，施杞，王擁軍，等.兔成骨細(xì)胞與納米氧化鋯強(qiáng)韌化高孔隙率磷酸鈣人工骨細(xì)胞支架生物相容性研究［J］.脊柱外科雜志，2004，2(4):209-212.