王艷紅， 吳志軍， 李麗陽， 于立權， 葛文中

（黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學技術學院，大慶 163319）

由茄鏈格孢菌［Alternariasolani（Ellis et Martin）Sorauer］引起的番茄早疫病是危害番茄產(chǎn)量的嚴重病害［1－2］，生產(chǎn)上主要以化學藥劑進行防治，但易造成環(huán)境污染及食品安全等問題［3－4］，因此，探索防治番茄早疫病的新方法或新途徑已迫在眉睫。近年來，放線菌作為生物活性物質(zhì)的重要來源已受到廣大學者的關注［5］。生防放線菌WL07是本實驗室篩選到的對番茄早疫病有較好拮抗效果的優(yōu)良菌株［6－7］，為進一步提高該菌的抑菌活性，采用自然選育、紫外線和硫酸二乙酯誘變對WL07菌株進行改良，為今后番茄早疫病的生物防治及該菌株的工業(yè)化開發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與培養(yǎng)基

1.1.1 供試菌株

放線菌WL07及番茄早疫病菌（Alternariasolani）均為本實驗室保存菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基

高氏一號合成培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）。搖瓶 培 養(yǎng) 基：蔗 糖 28.1g／L，酵 母 膏2.0g／L，（NH4）2SO410.0g／L，CaCO31.0g／L，F(xiàn)e－SO40.1g／L，pH7.2（滅菌前），0.1MPa滅菌20min，備用。

1.2 方法

1.2.1 菌株的自然選育

菌株WL07的自然選育及采用平板計數(shù)法對菌體濃度進行測定均參照文獻［8］進行。

1.2.2 篩選方法

將編號轉(zhuǎn)接的試管，挑取一耳環(huán)接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進行復篩，以番茄早疫病菌為檢定菌，采用管碟法［9］進行抑菌活性的測定，十字交叉法測量抑菌圈直徑的大小，選擇抑菌圈直徑較大的菌株保存，備用。

1.2.3 紫外線誘變

經(jīng)自然選育獲得的菌株制成孢子懸浮液，將其置于9cm的無菌培養(yǎng)皿中，因存在光復活作用［10］，故在紅光下，以鈍化光復活酶，采用事先預熱的功率為15W，波長260nm的紫外燈在約30cm處開皿照射30、60、90、120s。誘變結束后，分別吸取50μL處理的樣品用三角涂布棒涂勻于事先倒好的平板中，紗布包好培養(yǎng)皿，倒置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至菌落長出，分別測定致死率及正變率，確定最佳誘變時間。致死率及正變率公式如下：

1.2.4 硫酸二乙酯（DES）誘變

經(jīng)紫外誘變獲得的菌株制成孢子懸浮液，吸取50μL的樣品用三角涂布棒涂勻于事先倒好的DES濃度為0.5%、1%和2%的平板中，以不含DES的為對照，28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至菌落長出，分別測定致死率及正變率。

1.2.5 突變株的篩選

將經(jīng)硫酸二乙酯（DES）誘變長出的菌落挑選出100個單孢菌株，分別接種于斜面培養(yǎng)基上，放入28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5d，然后對突變株進行搖瓶發(fā)酵，生物測定，并編號，確定高產(chǎn)的突變株，保存。

1.2.6 突變株的傳代培養(yǎng)與穩(wěn)定性

將篩選出的突變菌株分別轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基上傳代5代，對每一代菌株搖瓶發(fā)酵，進行生物測定，重復3次，觀察突變株的穩(wěn)定性，最后確定高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的突變株。

2 結果與分析

2.1 菌株的自然選育

產(chǎn)生菌經(jīng)自然選育，菌落形態(tài)大部分為饅頭形，如圖1所示，挑取單個菌落100個，分別轉(zhuǎn)接在高氏一號斜面培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)5d，然后對每個菌株進行生物測定，篩選出6株活性較高的菌株，編號 為S.tz－a、S.tz－b、S.tz－c、S.tz－d、S.tz－e、S.tz－f，抗菌效能均比出發(fā)菌株高（以抑菌圈直徑表示），出發(fā)菌株抑菌圈直徑為16.1mm（3次重復的平均值），因此將這6株菌株作為紫外線誘變的出發(fā)菌株，以期獲得生物效價更高的菌株。

圖1 自然選育的菌落形態(tài)Fig.1 Colonial morphology of natural breeding

2.2 紫外線誘變

自然選育的6株菌株，經(jīng)紫外線處理后，除了出現(xiàn)與自然選育相同的菌落形態(tài)外，還出現(xiàn)5種不同的菌落形態(tài)，如圖2所示。各菌株的孢子致死率及正變率大致呈相同趨勢，結果如表1所示，趨勢曲線如圖3所示。

表1 紫外線誘變結果1）Table 1 The results of UV mutagenesis

圖2 紫外誘變后的菌落形態(tài)Fig.2 Colonial morphology after UV mutagenesis

圖3 不同紫外線照射時間下致死率與正突變率的關系Fig.3 The relationships between lethality and positive mutation rate under different mutation time

從表1可以看出，紫外線照射30s時，致死率約15%，菌落形態(tài)特征基本與自然選育后的相似，無特殊菌落形態(tài)出現(xiàn)；照射60s時，致死率約75%，正變率約22%；照射90s時，致死率約93%，正變率約39%；照射120s時孢子的致死率在99%左右，但正變率較低，不到5%，因此綜合考慮，確定最佳誘變劑量為90s。分別將這6種形態(tài)的菌落進行轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，搖瓶發(fā)酵，生物測定。結果表明，紫外線誘變后，高效價的菌株仍然是饅頭形，但其出現(xiàn)頻率不高，多以褶皺形、草帽形為主，但考慮到饅頭型菌落生長速率快，產(chǎn)孢能力強等因素，在選育良種時選取此種類型菌落。經(jīng)搖瓶發(fā)酵，生物測定，又挑選出6株活性較強的菌株，編號S.tz－A、S.tz－B、S.tz－C、S.tz－D、S.tz－E、S.tz－F，用來作為硫酸二乙酯誘變的菌株。

2.3 硫酸二乙酯（DES）誘變

菌種選育中，物理誘變和化學誘變可以綜合使用［11］。一般認為，單因子誘變處理效果不及復合誘變處理［12］。經(jīng)紫外誘變篩選的6株菌S.tz－A、S.tz－B、S.tz－C、S.tz－D、S.tz－E、S.tz－F 分 別 制 成孢子懸浮液，吸取50μL的樣品用三角涂布棒涂勻于事先倒好的DES濃度為0.5%、1%和2%的平板中，以不含DES的為對照，28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至菌落長出，分別測定致死率及正變率，結果如表2所示，在0.5%DES濃度下，致死率在22%～25%之間，正變率在10%以下，較低；在1%DES濃度下，6株菌S.tz－A、S.tz－B、S.tz－C、S.tz－D、S.tz－E、S.tz－F的致死率在70%～75%之間，正變率在37%左右；在2%DES濃度下，致死率雖然明顯提高至90%以上，但致死率高不一定效果好［13］，正變率下降約50%左右，出現(xiàn)負效應較明顯，因此，選擇1%DES濃度下抑菌圈直徑大于26mm的菌株作為備用菌株，將其編號S.tz－10、S.tz－22、S.tz－36、S.tz－45。

表2 不同濃度硫酸二乙酯（DES）誘變結果Table 2 The mutagenesis results of different DES concentrations

2.4 傳代穩(wěn)定性

經(jīng)過誘變后的菌株，生物活性高的不一定是高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn) 的［14］。菌 株S.tz－10、S.tz－22、S.tz－36、S.tz－45是經(jīng)過紫外誘變和硫酸二乙酯誘變的，將這4株菌進行傳代培養(yǎng)5代，搖瓶發(fā)酵后生物測定穩(wěn)定性，以抑菌圈直徑大小表示，結果見表3，發(fā)現(xiàn)誘變后抑菌圈直徑最大的菌株S.tz－36在連續(xù)培養(yǎng)5代后其抑菌活性降低，而效價第二高的菌株S.tz－22在連續(xù)培養(yǎng)5代后其穩(wěn)定性較好，基本保持不變，抑菌圈直徑為26.8mm，是出發(fā)菌株的1.66倍，所以選擇菌株S.tz－22作為本試驗的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)菌株，用以保存?zhèn)溆谩?/p>

表3 穩(wěn)定性結果1）Table 3 The results of stability

3 結論與討論

放線菌是一類與人們生產(chǎn)和生活關系極為密切的微生物，目前從微生物中發(fā)現(xiàn)的大約8 000多種生物活性物質(zhì)中，近70%是由放線菌產(chǎn)生的，具有巨大經(jīng)濟價值及重要醫(yī)學意義，如抗腫瘤的博萊霉素、絲裂霉素，抗結核的卡那霉素。放線菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物因其具有無污染、不易產(chǎn)生抗藥性等特點而制備的微生物農(nóng)藥，已成為新農(nóng)藥研發(fā)的主體及未來農(nóng)藥的發(fā)展趨勢［15－16］，如有效防治水稻紋枯病的井岡霉素。因此，生物農(nóng)藥備受人們的關注，生防菌劑的開發(fā)業(yè)已成為研究的熱點。

目前，防治番茄早疫病這種世界性病害的有效藥劑為二甲酰亞胺類殺菌劑異菌脲，具有保護和一定的治療作用，但長期使用該藥劑產(chǎn)生抗藥性［17］。生物防治上，國內(nèi)外已報道了一些細菌、放線菌對番茄早疫病的拮抗、抑制及防治等作用。國內(nèi)研究者周防震和彭振坤［18］篩選到酵母菌；高芬等［19］篩選出拮抗細菌；李永麗［20］、任璐等［21］篩選到內(nèi)生細菌；楊冬靜等［22］篩選到枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）NJ＿18菌株，均對番茄早疫病有拮抗作用。而國外研究者并沒有專門以番茄早疫病菌為防治對象進行拮抗微生物的篩選研究，主要將拮抗菌引入果實表面防治采后病害，獲得了一些有較好防效的拮抗菌株。在本研究中，主要以對番茄早疫病菌具有拮抗作用的生防放線菌WL07為研究對象，采用自然選育、紫外線和硫酸二乙酯誘變進行菌種選育，提高了誘變率，達到了成功選育高產(chǎn)菌株的目的，結果表明S.tz－22抑菌圈直徑為26.8mm，是出發(fā)菌株的1.66倍，該菌株具有較好開發(fā)前景。

綜上所述，應用誘變育種技術，對微生物菌株進行菌種選育，得到目的菌株S.tz－22，但該菌株距離工業(yè)化水平還有一定的差距，因此在后續(xù)研究中，可以嘗試運用激光、生物誘變劑等新的誘變因子，或者在技術選擇上應用基因工程手段對其進行育種。篩選的方法上，建立可靠的模型，理性篩選，提高篩出率，加快菌株的育種進程，以期為其工業(yè)化應用奠定基礎。有關該菌株抗菌活性成分的結構、作用機制及后期的制劑工藝等方面還有待進一步研究。

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