孫海濤

HPLC法同時(shí)測定清熱通淋片中苦參堿和氧化苦參堿的含量

孫海濤

目的采用反相高效液相色譜法同時(shí)測定清熱通淋片中苦參堿和氧化苦參堿的含量。方法使用Capcell C18 色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇-磷酸鹽緩沖液（PH3.0）（7：93）（磷酸鹽緩沖液配制：準(zhǔn)確量取磷酸二氫鉀3.402g溶解于1000mL水中，用磷酸調(diào)PH值至3.0），流速為0.8mL?min-1，檢測波長220nm，柱溫為40℃。結(jié)果苦參堿和氧化苦參堿進(jìn)樣量在0.3118～4.6770μg和0.02976～0.44640μg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好；平均回收率（n=6）分別為97.1 %和98.4%，RSD分別為0.24%和1.48%。結(jié)論本法簡便、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可為清熱通淋片的質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

清熱通淋片；苦參堿，氧化苦參堿；高效液相色譜法

清熱通淋片主要成分是中藥制劑，分別為苦參、爵床、硼砂、白茅根四種中藥，或是含有提取物復(fù)方制劑，具有的臨床作用是解熱、利尿、通淋。較常用于下焦?jié)駸崴聼崃?。癥見：小便頻急、尿道刺痛、尿液混濁、口干苦等，以及急性下尿路泌尿系統(tǒng)感染見于上述癥狀者。苦參中含有苦參堿、氧化苦參堿等生物堿類成分，具有清熱燥濕、殺蟲、利尿的作用[1]。苦參中生物堿含量測定方法包括比色法，薄層色譜掃描法和高效液相色譜法等[2]。近些年發(fā)表的應(yīng)用高效液相色譜法的文章比較小，同時(shí)較多的文獻(xiàn)應(yīng)用C18色譜柱進(jìn)行檢測苦參堿含量等主要成分[3]或是應(yīng)用氨基色譜柱同時(shí)檢測氧化苦參堿含量和苦參堿含量，罕見應(yīng)用C18色譜柱時(shí)進(jìn)行氧化苦參堿及苦參堿文獻(xiàn)的報(bào)道。本文中所參考的文獻(xiàn)操作方法的流動(dòng)相，選取用同時(shí)進(jìn)行優(yōu)化色譜，創(chuàng)建應(yīng)用反相高效液相色譜法，應(yīng)用C18色譜柱時(shí)進(jìn)行氧化苦參堿的含量檢測和復(fù)方制劑中苦參堿含量的檢測。本方法操作簡便，精密度好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

1 儀器與試藥

島津LC-2010高效液相色譜儀（包括四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣儀、真空脫氣儀、柱溫箱、Class VP色譜工作站、紫外檢測儀），AE-160型電子分析天平，AG-135型電子分析天平，KQ-500E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。對照品為氧化苦參堿（生產(chǎn)批號批號110780- 200506）和苦參堿（產(chǎn)品批號為110805-200306）在中國藥品生物制品檢定所采購；甲醇、磷酸均為色譜純。采用其它試劑為分析純，應(yīng)用的水為超純水。清熱通淋片（規(guī)格：片芯重0.39g，江西杏林白馬藥業(yè)有限公司）。

2 方法及結(jié)果

2.1 對照品溶液配制方法準(zhǔn)確量取15mg苦參堿作為對照品、準(zhǔn)確量取8mg氧化苦參堿作為對照品，放置在10mL量杯內(nèi)，加入適量的甲醇溶解同時(shí)稀釋到預(yù)定刻數(shù)，攪拌均勻，準(zhǔn)確稱取5mL混合后對照品溶液，放置在25mL量杯內(nèi)，用磷酸鹽緩沖液（PH3.0）稀釋至預(yù)定刻度攪拌均勻即可。

2.2 供試品溶液配制方法在進(jìn)行供試品溶液配制時(shí)應(yīng)去除包衣，準(zhǔn)確稱量研磨成細(xì)粉末，準(zhǔn)確量取1.0g，放置在帶有瓶塞的圓錐瓶中，準(zhǔn)確量取50mL三氯甲烷加入，量取1mL濃氨試液加入置具塞錐形瓶中，密閉瓶塞充分?jǐn)嚢杈鶆虿⑶异o止24小時(shí)以上，超聲處理（功率500W，頻率40kHz）30分鐘，冷卻再次進(jìn)行稱重，同時(shí)應(yīng)用三氯甲烷充填補(bǔ)足缺少的劑量充分?jǐn)嚢杈鶆?，進(jìn)行濾過。精密量取續(xù)濾液25mL，回收溶劑至干，立即取下，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，轉(zhuǎn)移至l0mL量瓶中，加磷酸鹽緩沖液（PH3.0）稀釋至預(yù)計(jì)刻度，充分?jǐn)嚢杈鶆蛲瑫r(shí)進(jìn)行過濾，即可獲得所需溶液。

2.3 陰性樣品溶液配制方法準(zhǔn)確量取苦參的陰性樣品，同“2.2”項(xiàng)下方法操作，配制獲得陰性樣品溶液。

圖1 HPLC色譜圖

2.4 線性相關(guān)性分析精密量取對照品含量溶液劑量分別為1μL、3μL、5μL、10μL、15μL，依次注入相色譜儀內(nèi)，同時(shí)進(jìn)行峰面積的檢測，同時(shí)橫坐標(biāo)為進(jìn)樣量（μg），縱坐標(biāo)為峰面積值，并且進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，苦參堿及氧化苦參堿的回歸方程計(jì)算為Y＝1039908.67X+3976.03，r＝1.0000；Y＝1028954.62X-1574.89，r＝1.0000，實(shí)踐結(jié)果顯示：苦參堿進(jìn)樣量在0.3118μg～4.6770μg，氧化苦參堿進(jìn)樣量在0.02976μg～0.44640μg之間，同峰面積存在較好的線性相關(guān)。

2.5 精密度試驗(yàn)過程精確量取同種供試品的溶液，依據(jù)以上條件，反復(fù)進(jìn)行6次檢測，檢測峰面積。結(jié)果顯示苦參堿和氧化苦參堿峰面積的RSD（n=6）分別為0.84%，2.97%。試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)精密度相對較好。

2.6 穩(wěn)定性的試驗(yàn)過程精確量取同種供試品溶液，依據(jù)以上條件分別在0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h進(jìn)行精密檢測，同時(shí)對氧化苦參堿和苦參堿和峰面積的 RSD（n=7）分別為1.21%和1.47%。因此結(jié)果表明12小時(shí)內(nèi)的供試品溶液情況較為穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)方法準(zhǔn)確稱取清熱通淋片（批號20121101）2g，共6份，依據(jù)“2.2”項(xiàng)配制方法量取供試品溶液，依據(jù)以上條件進(jìn)行檢驗(yàn)。實(shí)踐結(jié)果顯示苦參堿和氧化苦參堿的含量相加和的平均值為（n=6）分別為1.1mg?mL-1，RSD分別為0.48%，表明此方法重復(fù)性較好。

2.8 回收率試驗(yàn)方法準(zhǔn)確稱取適量的清熱通淋片（批號：20121101）粉末6份，每份0.5g，每份分別精密加入含苦參堿1.347mg·mL-1和氧化苦參堿0.194mg?mL-1的加入1mL對照品的甲醇溶液，依據(jù)“2.2” 項(xiàng)配制方法量取試驗(yàn)需要溶液，依據(jù)以上條件進(jìn)行檢驗(yàn)分析檢測，計(jì)算和回收。

2.9 樣品測定率結(jié)果苦參堿和氧化苦參堿的平均回收率（n=6）分別為97.1%和98.4%，RSD分別為0.24%和1.48%。

分別取不同批次的清熱通淋片，依據(jù)“2.2” 項(xiàng)配制方法量取供試品溶液。精密量取5μL供試品溶液，依據(jù)以上條件進(jìn)行檢驗(yàn)分析檢測，同時(shí)進(jìn)行峰面積的測定，同時(shí)應(yīng)用外標(biāo)方法進(jìn)行計(jì)算氧化苦參堿和苦參堿精確含量，實(shí)踐結(jié)果分析顯示3批樣品含量為苦參堿和氧化苦參堿之和分別為1.14、1.13、2.37mg?mL-1。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

3.2 供試品制備方法的選擇分別對采用光譜掃描針對氧化苦參堿和苦參堿進(jìn)行檢測，根據(jù)試驗(yàn)掃描結(jié)果顯示，同時(shí)依據(jù)2010年版中國藥典中的苦參藥材含量檢測波長[1]，故制定測定波長為220nm。

選用樣品為濃氨試液-氯仿超聲、鹽酸-甲醇超聲、濃氨試液-甲醇超聲。實(shí)踐結(jié)果證明，鹽酸-甲醇超聲掃描含有較多的雜質(zhì)，不能正常進(jìn)行分析；所以采用濃氨試液-甲醇超聲提取的結(jié)果顯示含量最高，但掃描含有較多的雜質(zhì)，不能達(dá)到和接近標(biāo)準(zhǔn)基線分離；應(yīng)用濃氨試液-氯仿超聲掃描檢測，可相對較高提取含量，同時(shí)在進(jìn)行掃描檢測時(shí)存在較少雜質(zhì)，相對較好的樣品分離度，因此采用濃氨試液-氯仿為標(biāo)準(zhǔn)的提取溶劑。

3.3 色譜柱的考察中國藥典2010版一部中藥材“苦參”含量測定項(xiàng)下采用氨基鍵合硅膠為填充劑的色譜柱同時(shí)測定苦參堿和氧化苦參堿[1]，氨基鍵合硅膠柱較少應(yīng)用，推廣起來受一定限制，并且試驗(yàn)結(jié)果表明，使用氨基鍵合硅膠柱出峰較快，難于分離成分復(fù)雜樣品。故本文建立了一種全新的采用普通C18柱同時(shí)測定處方中苦參堿和氧化苦參堿的方法。

3.4 分離條件的選擇采用C18色譜柱比較不同的流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液（三乙胺調(diào)PH值至8.0）、乙腈-磷酸鹽緩沖液（PH6.8）-三乙胺、甲醇-磷酸鹽緩沖液（PH3.0）。結(jié)果表明，以甲醇-磷酸鹽緩沖液（PH3.0）平衡時(shí)間短，分離效果佳，該流動(dòng)相可使苦參堿和氧化苦參堿均能達(dá)到基線分離。

3.5 選擇進(jìn)樣量的方法因供試品溶液的流動(dòng)相和極性的極性存在比較大差異性，過大的進(jìn)樣量會(huì)導(dǎo)致峰型較差，發(fā)生分裂及峰變寬，過小的進(jìn)樣量會(huì)導(dǎo)引起不準(zhǔn)確的進(jìn)樣，因此5μL為標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)樣量定最為合適。

3.6 小結(jié)本方法可以采用普通C18色譜柱準(zhǔn)確、靈敏的同時(shí)測定清熱通淋片中苦參堿和氧化苦參堿這兩種生物堿的含量，苦參堿和氧化苦參堿均能達(dá)到基線分離，重復(fù)性及回收率較好，結(jié)果可靠，為清熱通淋片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了依據(jù)。

[1] 中華人民共和國衛(wèi)生部.中國藥典2010年版一部[S].北京：人民衛(wèi)生出版社,2010：188.

[2] 蔣珍藕.苦參堿的提取工藝及測定方法的研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2005,11(08)：90.

[3] 中華人民共和國衛(wèi)生部.中國藥典2005年版一部[S].北京：人民衛(wèi)生出版社,2005：497.

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1673-5846(2013)06-0202-04

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