尚琨張鵬周璐王瑧曹越李影奕

1.復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院實驗研究中心，復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海 200032；

2.復旦大學藥學院，上海 201203

ELISA高通量篩選PIM靶向抑制劑的研究

尚琨1張鵬2周璐2王瑧1曹越1李影奕1

1.復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院實驗研究中心，復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海 200032；

2.復旦大學藥學院，上海 201203

背景與目的：Pim家族是具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的原癌基因，包括Pim-1、Pim-2、Pim-3。研究發(fā)現(xiàn)，Pim能夠抑制細胞凋亡，促進細胞增殖，導致腫瘤發(fā)生。本研究利用ELISA反應原理建立高通量篩選體系，對Pim抑制劑進行篩選，為藥物的應用和解決惡性腫瘤臨床治療的難題提供研究基礎。方法：通過計算機輔助藥物設計的手段，以蔓生百部堿母核三環(huán)酰胺作為核心結構合成系列衍生物；利用Pim重組蛋白和Bad重組蛋白可以與Ni2+特異性結合的親和層析原理進行重組蛋白的純化精制；利用ELISA方法，通過Pim激酶磷酸化促凋亡蛋白分子Bad在112位絲氨酸的反應，建立篩選Pim靶向抑制劑的體系。結果：0.01 mmol/L的IPTG在37 ℃條件下，誘導Bad蛋白2 h，可以獲得最大量的可溶性Bad重組蛋白；0.02%的阿拉伯糖在37 ℃條件下，誘導Pim-1、Pim-2、Pim-3蛋白3 h，可以獲得最大量的Pim重組蛋白；ELISA結果顯示，Pim激酶與Bad底物之間的作用存在劑量依賴性反應關系，進而成功建立藥物篩選體系；初步篩選出低分子化合物T-18，在體外能有效抑制Pim激酶活性。結論：利用ELISA反應原理建立的篩選藥物方法，是一種經濟、簡單、快速、高效、敏感的篩選手段，并初步篩選出小分子化合物T-18，能夠抑制Pim激酶活性，阻斷Pim對凋亡蛋白分子Bad的磷酸化過程，進而抑制腫瘤的發(fā)生。

Bad；Pim；ELISA,；藥物篩選；Pim靶向抑制劑

［Key words］Bad; Pim; ELISA; Drug screening; Pim kinase inhibitors

Pim家族是具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的原癌基因，包括Pim-1、Pim-2、Pim-3［1］。Pim蛋白對某些正常的或腫瘤細胞的增殖和細胞周期具有調節(jié)功能，能增強細胞的抗凋亡作用［2］。Pim-1最早是作為莫羅尼小鼠白血病病毒的前病毒插入點而被發(fā)現(xiàn)［3］。同時，Pim-1激酶也是絲氨酸激酶和(或)蘇氨酸激酶Pim家族的第一位成員，隨后發(fā)現(xiàn)其也在前列腺癌［4］、急性髓細胞性白血病［5］等惡性腫瘤中過度表達。Pim-2也被證實為一個MMLV前病毒整合的共同位點，能導致T細胞淋巴瘤的發(fā)生［6］。Pim-2的反義核苷酸已被證實具有抑制前列腺腫瘤DU2145細胞系的增殖作用［7］。Pim-3最初是由大鼠細胞系PC12去極化誘導的基因而被首先報道［8］。最近研究發(fā)現(xiàn)，Pim-3蛋白在內胚層來源的肝癌［9］、胰腺癌［10］、結腸癌［11］和胃癌［12］組織中過度表達，而在正常組織中不表達，還發(fā)現(xiàn)在胰腺癌細胞株中，Pim-3通過磷酸化凋亡蛋白分子Bad，使其失活，從而抑制胰腺癌細胞的程序化死亡［10］。

在使用小分子化合物對腫瘤治療的研究方面，蛋白激酶已成為一個主要的靶點［13］。針對Pim的抑制劑是通過與ATP競爭性結合Pim的ATP結合位點，抑制Pim激酶活性，從而抑制Pim的底物磷酸化，抑制腫瘤發(fā)生。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，以蔓生百部堿為基礎合成的各種衍生化合物即是針對Pim的分子靶向治療藥物［14］，能夠抑制Pim激酶活性，促進腫瘤細胞凋亡。因此，本實驗是在此基礎上通過ELISA實驗建立高通量篩選體系，篩選出抑制Pim激酶的小分子化合物，為分子靶向治療惡性腫瘤奠定研究基礎。

1 材料和方法

1.1 試劑

大腸桿菌感受態(tài)細胞DL21和DL21(DE3)分別購自全式金生物技術有限公司和天根生化科技有限公司，IPTG和阿拉伯糖購自Sigma公司，考馬斯亮藍R250為Amresco公司產品，氨芐青霉素購自Sigma公司，卡那霉素購自天根生化科技有限公司，Bugbuster蛋白抽提試劑、核酸酶和溶菌酶為Merck公司產品，蛋白酶抑制劑為Roche公司產品，Ni2+填料為GE healthcare公司產品，尿素和咪唑購自經科宏達生物有限公司，ELISA專用96孔板為Merck公司產品，激酶緩沖液和ATP為Cell Signaling technology 公司產品，兔抗人pBad(Ser112)抗體為Cell Signaling technology 公司產品，堿性磷酸酶標記的二抗為Pierce公司產品，磷酸對硝基苯酯和二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma公司。

1.2 Bad蛋白的表達和純化

含有人全長Bad cDNA核苷酸序列的重組質粒pET29a-Bad轉入大腸桿菌感受態(tài)細胞DL21(DE3)中，在含有卡那霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用分光光度計測得A值為0.4～0.6時，加入不同濃度(0.1、0.5、1.0 mmol/L)的IPTG誘導Bad蛋白表達，37 ℃分別誘導2、3 h，以未加入IPTG作為陰性對照組，經過SDS-PAGE以及考馬斯亮藍染色后，確定能夠最大誘導Bad蛋白產生的濃度和時間，并在此條件下，進行Bad蛋白的大量表達。

收集大腸桿菌菌體沉淀，加入蛋白抽提試劑Bugbuster(含有蛋白酶抑制劑和溶菌酶)，室溫下?lián)u床溫育20 min，4 ℃離心收集上清液。將上清液加入到Ni2+柱中，隨后依次加入漂洗緩沖液(300 mmol/L NaCl、50 mmol/L PBS、20 mmol/L咪唑，pH為8.0)和洗脫緩沖液(300 mmol/L NaCl、50 mmol/L PBS、250 mmol/L咪唑，pH為8.0)，收集純化后的Bad蛋白，經SDS-PAGE以及考馬斯亮藍染色后確定純度。

1.3 Pim蛋白的表達和純化

含有人全長Pim-3 cDNA核苷酸序列的重組質粒pBAD/Thio-TOPO-pim-3轉入大腸桿菌感受態(tài)細胞DL21中，在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用分光光度計測得A值為0.4～0.6時，加入不同濃度(0.02%、0.1%、0.2%)的阿拉伯糖誘導Pim-3蛋白表達，37 ℃誘導3 h，以未加入阿拉伯糖作為陰性對照組，經過SDS-PAGE以及考馬斯亮藍染色后，確定能夠最大程度誘導蛋白表達的濃度和時間。并分別取該濃度下的全菌液、上清液和沉淀，染色后確定蛋白的含量。大量誘導Pim-3蛋白，收集大腸桿菌菌體沉淀，加入蛋白抽提試劑Bugbuster(含有蛋白酶抑制劑和溶菌酶)，室溫下?lián)u床溫育20 min，4 ℃離心收集沉淀。用8 mol/L尿素(pH為7.8)變性蛋白，4 ℃離心收集上清液加入到Ni2+柱中，隨后依次加入漂洗緩沖液(500 mmol/L NaCl、20 mmol/L磷酸鹽緩沖液、8 mol/L尿素，PH為6.0)和洗脫緩沖液(500 mmol/L NaCl、20 mmol/L磷酸鹽緩沖液、8 mol/L尿素、200 mmol/L咪唑，pH為4.0)，收集純化后的Pim-3蛋白，經SDS-PAGE以及考馬斯亮藍染色后確定純度。最后對變性后的純化蛋白通過透析的方式進行復性。

人全長Pim-1 和Pim-2 cDNA核苷酸序列插入到pBAD/Thio-TOPO載體中，Pim-1和Pim-2重組蛋白的精制方法同Pim-3。

1.4 ELISA篩選體系的建立

已有研究表明，Pim家族激酶能夠使Bad(Ser112)蛋白發(fā)生磷酸化［10,15-16］，因此可以建立體外激酶活性檢測體系。首先，96孔板每孔包被100 μL pH為9.6的碳酸鹽緩沖液(含Bad蛋白3 μg/mL)4 ℃溫育過夜。洗板3次后，PBS(1%BSA) 37 ℃封閉1 h，洗板3次，加入40 μL激酶緩沖液、ATP及各種不用濃度梯度的激酶30 ℃反應1 h。隨后分別加入100 μL兔抗人pBad(Ser112)抗體和相應二抗，37 ℃反應1 h，最后每孔100 μL磷酸對硝基苯酯室溫避光反應30 min進行顯色，出現(xiàn)明顯顏色差異時，用3 mol/L NaOH中止反應。利用多功能酶標儀檢測405mm和450 nm時的A值。有些實驗反應在ELISA反應液中加入一定濃度的小分子化合物一起溫育。

1.5 蔓生百部堿合成中間體的制備

蔓生百部堿合成中間體依據前述制備［17］。合成順序依次為T-10＞T-6、 T-10＞T-4＞T-5、T-10＞T-2＞T-3、T-10＞T-18。實驗開始前將該化合物溶于DMSO中，終濃度為100 mmol/L。已有文獻報道，T-2能夠抑制Pim的活性，故此作為陽性對照；而T-10作為陰性對照［14］。

1.6 統(tǒng)計學處理

實驗數據采用SPSS 17.0軟件進行整理和統(tǒng)計分析。計量數據以表示，采用χ2檢驗和Student’s t-test對資料進行統(tǒng)計分析， P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.01為差異有顯著統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 Bad蛋白誘導條件的確立和精制純化

在IPTG濃度分別為0.1、0.5、1.0 mmol/L的條件下分別誘導Bad重組蛋白，以不加IPTG組為陰性對照?？捡R斯亮藍染色結果顯示，與陰性對照組相比較，在IPTG存在的條件下，檢測到Bad蛋白表達條帶，當濃度為0.1 mmol/L時檢測到Bad重組蛋白表達量最多，其相對灰度值之間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。而不同誘導時間的蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，考慮到IPTG對大腸菌生長的毒性影響，我們選擇采用0.1 mmol/L IPTG處理2 h，在37 ℃條件下，誘導表達Bad重組蛋白。純化的Bad蛋白帶有His標簽，可以與Ni2+發(fā)生特異性結合，在低濃度咪唑條件下漂洗雜蛋白，高濃度咪唑條件下洗脫目的蛋白，根據這一原理，我們對Bad蛋白進行了純化。考馬斯亮藍染色結果顯示，只有單一目的條帶(圖1A、B)。提示Bad蛋白精制純化成功，蛋白純度可達到95%以上，能夠用于體外Pim激酶反應。

2.2 Pim蛋白誘導條件的確立和精制純化

在阿拉伯糖濃度分別為0.02%、0.1%、0.2%的條件下誘導Pim-3蛋白，以不加阿拉伯糖誘導組為陰性對照?？捡R斯亮藍結果顯示(圖2A)，在阿拉伯糖存在條件下，檢測到Pim-3蛋白表達條帶，當濃度為0.02%時檢測到Pim-3重組蛋白表達量最多，其相對灰度值之間有顯著差異。

有文獻報道，Pim家族蛋白為包涵體蛋白［18］。因此，本研究在0.02%阿拉伯糖條件下誘導Pim蛋白，分別取全菌液、沉淀、上清液檢測(圖2B)，Pim-3蛋白主要存在于沉淀中，是以包涵體的形式存在。因此，對其的純化方法選用了變性復性的方式進行。本研究采用了同樣的誘導條件誘導Pim-1和Pim-2重組蛋白的表達。

純化的Pim蛋白帶有His標簽，可以與Ni2+發(fā)生特異性結合，根據這一原理，我們對Pim蛋白進行了純化。洗脫下來的Pim蛋白在PBS緩沖液中，采用尿素濃度梯度透析方法復性。考馬斯亮藍染色結果顯示，只有單一目的條帶(圖2C和圖3)。提示Pim蛋白精制純化成功，蛋白純度可達到95%以上。

2.3 ELISA體系建立

圖 1 IPTG誘導凋亡蛋白Bad的表達以及Bad重組蛋白的精制純化Fig. 1 The expression of Bad protein induced by IPTG and the purification of recombinant Bad protein

圖 2 阿拉伯糖誘導Pim-3重組蛋白的表達以及Pim-3重組蛋白的精制純化Fig. 2 The expression of Pim-3 protein induced by arabinose and the purification of recombinant Pim-3 protein

圖 3 Pim-1和Pim-2重組蛋白的精制純化Fig. 3 The purification of recombinant Pim-1 and Pim-2 proteins

本研究利用體外Pim激酶活性測定體系，檢測了上述精制純化蛋白的活性。在不同Pim激酶劑量(0、10、20、40、80、160、320 ng)梯度條件下，檢測其對底物Bad蛋白的磷酸化反應，結果顯示，隨著Pim激酶劑量的增加，A值呈現(xiàn)上升趨勢，當Pim激酶達到一定劑量時，Bad的磷酸化達到飽和，隨著Pim激酶劑量繼續(xù)增加A值呈現(xiàn)平臺期(圖4)。提示Pim激酶活性測定的ELISA體系成功建立，可以用于分子靶向治療藥物的篩選。

圖 4 ELISA方法測定Pim激酶活性Fig. 4 The determination of Pim kinase activity by ELISA

2.4 T-18可以抑制Pim激酶活性

Li等［14］的實驗結果顯示，蔓生百部堿合成中間體T-2可以在體內和體外抑制Pim-3的激酶活性，促進腫瘤細胞凋亡，抑制細胞增殖。本研究以T-2為先導化合物合成了一系列小分子化合物，利用體外Pim激酶活性測定體系，以T-10為陰性對照，T-2為陽性對照，對這些化合物進行了初篩。結果發(fā)現(xiàn)其中T-18可以一定程度抑制Pim激酶的活性(圖5，表1)，并且T-18對Pim-1和Pim-2激酶活性的抑制程度與Pim-3類似(圖5A)。顯示Pim-1、Pim-2和Pim-3在激酶結構域中有類似結構。Akt/PKB蛋白激酶可以磷酸化相似的作用底物Bad。因此，我們進一步探討了T-18對Akt1 和Akt2 激酶活性的影響。Akt1/2，是Akt1和Akt2激酶的特異性抑制劑，能明顯抑制Akt1 和Akt2的激酶活性，而T-18對其沒有抑制效果(圖5B)。因此，T-18可能特異性地抑制Pim激酶活性。

3 討 論

圖 5 小分子化合物對Pim激酶活性的抑制作用Fig. 5 The inhibitory activities of stemonamide synthetic intermediates on Pim kinase.

表 1 小分子化合物對Pim激酶的半數抑制劑量Tab. 1 The inhibitory activities of stemonamide synthetic intermediates on Pim kinase

惡性腫瘤是人類生命的主要殺手之一，由于傳統(tǒng)治療手段存在的缺點，分子靶向治療被認為是一種具有發(fā)展前景的治療方法，而蛋白激酶則成為了一個主要的靶點。作為靶向分子，應該具備在正常組織中不表達，而在腫瘤組織中過度表達，并且在腫瘤細胞的過度增殖中起到了不可或缺的調節(jié)作用，Li等［10］認為，Pim具備作為靶向治療分子的條件。因此，能夠進一步篩選出針對Pim激酶活性的特異性強，單位抑制劑量范圍內抑制效果更強的小分子化合物，將具有重要的科學意義和應用前景。而在篩選藥物時，建立一個能夠在普通實驗室里完成，且經濟、簡單、快速、有效、高通量的體外篩選體系至關重要。

高通量藥物篩選是一種優(yōu)化的微量分析方法，是藥物研制開發(fā)早期的最重要工具之一。利用這一技術能夠快速地進行大量藥物篩選，從中找到能選擇性作用于靶點的具有生物活性的化合物［19］。其中， ELISA是一種極為敏感的檢測方法，而且應用極為廣泛。有報道顯示，可以用ELISA方法高通量篩選拮抗性類肽藥物防治自身免疫病［20］。因此，本實驗也是通過建立ELISA體系篩選分子靶向藥物。我們發(fā)現(xiàn)，Pim能夠使凋亡蛋白分子Bad發(fā)生磷酸化，提示通過大腸桿菌提取的Pim蛋白具有激酶活性，并發(fā)現(xiàn)在不同劑量梯度下，Bad的磷酸化水平呈現(xiàn)上升趨勢，并能達到飽和，根據Pim和Bad之間存在的這一劑量依賴性反應關系，進而成功建立藥物篩選體系，并對能夠抑制Pim激酶活性的分子靶向藥物進行篩選，使獲得的藥物具備Pim選擇性強以及單位劑量抑制性強的特點。

Akt也是具有絲氨酸/蘇氨酸活性的蛋白激酶，與Pim-3有相似的作用底物。Akt也可以磷酸化促凋亡蛋白分子Bad，誘導腫瘤細胞過度增殖。Amaravadi等［21］認為，Akt是一個很好的靶向治療分子。Rhodes等［22］報道Akt的抑制劑GSK690693在一期臨床實驗中顯示了潛在的抗腫瘤活性。Akt-1、Akt-2、Akt-3廣泛表達在各種正常組織和器官，參與正常的生理活動。有報道顯示，敲除Akt的表達，可引起新生小鼠死亡、生長遲緩及腦發(fā)育不全［23-25］。Pim家族是選擇性表達在一些組織器官。Pim-1、Pim-2、Pim-3同時敲除，對小鼠的生長沒有顯著影響［26］，提示Pim蛋白激酶在正常生理活動中不起主要作用。因此，開發(fā)針對Pim-3的抑制劑，其產生的不良反應小于Akt。本研究結果顯示，與Akt特異性抑制劑Akt1/2相比，T-18能夠抑制Pim家族成員，而對Akt-1和Akt-2沒有明顯抑制作用。因此，推測T-18可能特異性抑制Pim家族激酶活性，為今后裸鼠胰腺原位癌的研究和臨床試驗提供有力的實驗數據，進而為進一步解決惡性腫瘤治療的臨床難題提供可行的方法。

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《抗癌》雜志征稿啟事

《抗癌》雜志于1988年創(chuàng)刊，主管單位為上海市科學技術協(xié)會，主辦單位為上海市抗癌協(xié)會，雜志刊號：CN31-1664/R ISSN 1008-3065。征稿欄目及內容如下。

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Screening of Pim kinase inhibitors by the establishment of high-throughput ELISA system

SHANG Kun1, ZHANG Peng2, ZHOU Lu2, WANG Zhen1, CAO Yue1, LI Ying-yi1(1.Cancer Research Laboratory, Fudan University Shanghai Cancer Center, Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China; 2.School of Pharmacy, Fudan University, Shanghai 201203, China)

LI Ying-yi E-mail: liyingyi@fudan.edu.cn

Background and purpose: Pim family is the proto-oncogene that exhibits serine/threonine kinase activity, containing Pim-1, Pim-2, Pim-3. Pim family has potent anti-apoptotic capacity, ultimately promoting tumor cells survival. This study aimed to establish a high-throughput system to screen the anti-cancer drugs targeting Pim kinase by ELISA. Methods: The stemonamide synthetic intermediates were synthesized using a radical cascade. The expression of Pim kinase proteins and Bad proteins were purified by bacterial system. A high-throughput ELISA screening was performed for in vitro Pim kinase assay. Results: Treatment with 0.01 mmol/L of IPTG for 2 hours at 37 ℃, the induction of Bad recombinant proteins was the maximum; Treatment with 0.02% of arabinose for 3 hours at 37 ℃, the induction of Pim-1, Pim-2, Pim-3 recombinant proteins was the maximum. ELISA results showed that the Pim kinase could phosphorylate Bad in a dose-dependent manner; we had found a low molecular weight compounds T-18, which could effective inhibit Pim kinase activity in vitro. Conclusion: We successfully established a screening system with Bad and Pim by ELISA. ELISA is a method for screening drug with high throughput, effect and sensitivity. Moreover, small molecule the compound T-18 that is screened by ELISA, can inhibit Pim kinase activities, ultimately reduce the amount of phosphorylated Bad and could induce apoptosis.

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.04.004

R73-34

：A

：1007-3639(2013)04-0260-07

2012-08-02

2013-01-20）

國家自然科學基金面上項目(No：30973476)；上海市浦江人才計劃(No：10PJ1402100)；復旦大學“985工程”三期腫瘤研究項目Ⅱ (No：985Ⅲ-YFX0102)。

李影奕 E-mail:liyingyi@fudan.edu.cn