西藏自治區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，西藏 拉薩 850000

CD14穩(wěn)定沉默胃癌細胞系的建立及其侵襲能力研究

李康 旦增 王中華 德吉 陳曉紅 劉明花

西藏自治區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，西藏 拉薩 850000

背景與目的：白細胞分化抗原14(cluster of differentiation antigen 14，CD14)為脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的高親和受體，能夠識別革蘭陰性菌、真菌以及結(jié)核桿菌并介導(dǎo)機體的炎性反應(yīng)，為病菌引發(fā)多種細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的第一步，在腫瘤組織以及癌細胞中常呈異常表達。近來有研究指出，CD14啟動子區(qū)的功能性突變能夠影響CD14的表達，并增加幽門螺桿菌感染后罹患胃癌的風(fēng)險，據(jù)此推測CD14與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本研究擬構(gòu)建CD14-shRNA干擾載體，建立CD14穩(wěn)定沉默的胃癌細胞系，初步探討CD14對胃癌細胞侵襲能力的影響，以期為胃癌發(fā)病機制的研究奠定實驗基礎(chǔ)。方法：根據(jù)shRNA引物設(shè)計原則設(shè)計并合成4條CD14-shRNA序列，構(gòu)建sh-CD14表達載體，轉(zhuǎn)染MGC-803細胞，G418篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系；RT-PCR檢測CD14 mRNA的表達；蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測CD14蛋白的表達；Transwell小室模型檢測細胞的侵襲能力。結(jié)果：測序結(jié)果表明，CD14-shRNA表達載體構(gòu)建成功并篩選得到了CD14穩(wěn)定沉默的胃癌細胞系，其CD14 mRNA以及蛋白的表達分別降低了71.7%%和63.4%；與對照組相比CD14-shRNA組細胞侵襲能力顯著降低，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論：成功構(gòu)建了CD14-shRNA干擾載體并獲得了CD14穩(wěn)定沉默的胃癌細胞系，初步證實CD14的沉默能夠影響胃癌細胞的侵襲能力。

白細胞分化抗原14；shRNA載體構(gòu)建；胃癌細胞；侵襲

［Key words］CD14; Construction of shRNA vector; Gastric cancer cells; Invasion

胃癌起源于胃壁最表層的黏膜上皮細胞，是世界上最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害著人類的健康。幽門螺桿菌(H.pylori)為微需氧革蘭氏染色陰性菌，被認(rèn)為是胃癌及胃黏膜相關(guān)淋巴癌的第一類致癌原。機體內(nèi)免疫因子的表達能夠影響幽門螺桿菌感染后的炎性反應(yīng)過程及其嚴(yán)重程度，最終決定細菌感染的結(jié)局。CD14為細菌內(nèi)毒素脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的高親和受體，主要表達于單核-巨噬細胞表面，參與LPS的識別、結(jié)合并介導(dǎo)下游一系列的炎性反應(yīng)。近來有研究指出CD14啟動子區(qū)的多態(tài)性與胃癌的易感性密切相關(guān)，推測其可能與CD14的表達改變進而影響機體對LPS的識別存在某種聯(lián)系［1］，本研究擬建立CD14穩(wěn)定沉默的胃癌細胞株，并探討其侵襲能力的變化，以期為CD14與胃癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

胃癌細胞株MGC-803由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所細胞庫提供；總RNA提取試劑盒、TIAN Script cDNA第一鏈合成試劑盒、2×Taq PCR Master Mix購自天根生化科技(北京)有限公司；CD14抗體購自santa cruz；GAPDH抗體購自Abcam公司；LipofectamineTM2000、G418購自Invitrogen；BamHⅠ、HindⅢ核酸內(nèi)切酶購自寶生物工程(大連)有限公司；Transwell孔板購自Corning公司；Matrigel膠購自BD公司；大腸桿菌DH5α和pGCsi-H1/Neo/GFP載體均由本實驗室保存；引物委托生工生物工程(上海)有限公司合成；其他藥品為國產(chǎn)分析純。

1.2 shRNA載體構(gòu)建

根據(jù)shRNA引物設(shè)計原則［2］，設(shè)計并合成4條shRNA序列以及1條陰性對照序列，序列結(jié)構(gòu)為：BamHⅠ酶切位點+Sense+Loop+Antisense+ HindⅡ酶切位點(表1)，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。參考文獻［3］和［4］的方法，取正反向寡核苷酸各1 μL，溶解于48 μL退火緩沖液中，90 ℃變性4 min后自然退火合成雙鏈。BamH Ⅰ和HindⅢ雙酶切線性化pGCsi-H1/Neo/GFP載體。取退火后的雙鏈2 μL，線性化載體6 μL，加入T4DNA連接酶以及10×T4連接酶緩沖液各1 μL，4 ℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)氨芐青霉素篩選后挑取陽性單菌落進行測序鑒定。

表 1 CD14干擾載體構(gòu)建所用shRNA序列信息Tab. 1 Information of the shRNA sequences used in the CD14 interference vector construction

1.3 細胞轉(zhuǎn)染及穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的篩選

將MGC-803細胞接種至含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基的6孔板，待細胞長至80%～90%融合時進行轉(zhuǎn)染。按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書配置溶液1與溶液2，將混合好的轉(zhuǎn)染試劑逐滴加入細胞中，將細胞置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h，換液為含20% RPMI-1640的培養(yǎng)液，48 h后于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。胰蛋白酶消化陽性細胞并傳代，換液為含800 μg/mL G418的完全培養(yǎng)液，每2～3 天更換1次培養(yǎng)液，2周后將G418濃度降至400 μg/mL維持篩選，至熒光顯微鏡下觀察到細胞形態(tài)正常且表達較強綠色熒光蛋白時分離陽性克隆并擴大培養(yǎng)。

1.4 RT-PCR檢測

TRIzol法提取各組細胞總RNA，采用cDNA第一鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照引物設(shè)計原則設(shè)計PCR引物，CD14的上、下游引物序列分別為：5’-TCAGAGG TTCGGAAGACTTATCG-3’，5’-CTTTAGAAA CGGCTCTAGGTTGAGA-3’，擴增片段長度239 bp，β-actin上、下游引物序列分別為：5’-CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCT TG-3’，5’-CTGTCACCTTCACCGTTCCAGT TT-3’，擴增片段長度200 bp。PCR反應(yīng)體系如下：cDNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL，2×Taq PCR Master-mix 10 μL，ddH2O補足總體積至20 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共30個循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后于1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍照成像，以β-actin為內(nèi)參進行灰度分析。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測

在細胞中加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法定量蛋白。取4 μg蛋白進行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉5 min。加入稀釋一抗(CD14按1∶500稀釋，GAPDH按1∶1 000稀釋)，4 ℃溫育過夜。加入1∶4 000倍稀釋的二抗，37 ℃溫育45 min。溫育結(jié)束后，ECL底物發(fā)光法進行曝光。洗滌PVDF膜，剝脫后加入1∶10 000內(nèi)參抗體，4 ℃溫育過夜，曝光成像。

1.6 Transwell檢測

選擇對數(shù)生長期的細胞進行實驗，調(diào)整細胞密度至1×106個/mL，接種100 μL細胞于已包被好Matrigel的Transwell小室的上室，下室加入500 μL完全培養(yǎng)液，置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后取出小室，擦去未侵襲的細胞，4%甲醛室溫固定20 min，蘇木素染色3 min，倒置顯微鏡下(200×)計數(shù)侵襲細胞數(shù)，每組選取5個視野，計算均數(shù)。

1.7 數(shù)據(jù)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 CD14-shRNA載體的鑒定

經(jīng)測序鑒定，4個CD14-shRNA載體均含有相應(yīng)的shRNA片段(圖1)，且序列未發(fā)生突變，表明已成功構(gòu)建了CD14-shRNA載體。

2.2 干擾效率鑒定以及穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的篩選

將CD14-shRNA-3干擾片段連接入帶有GFP熒光標(biāo)記的pGCsi-H1/Neo/GFP后轉(zhuǎn)染細胞，轉(zhuǎn)染48 h即可觀察到發(fā)出綠色熒光的細胞(圖2B)，表明重組載體已得到了表達。G418篩選4周后，細胞大面積發(fā)出綠色熒光(圖2C)，表達率達90%以上，表明已得到CD14-shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系?；叶确治鼋Y(jié)果表明，與未轉(zhuǎn)染組相比CD14-shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組CD14 mRNA的相對表達量降低了71.7%(圖3)，蛋白的相對表達量降低了63.4%(圖4)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，表明此干擾載體有效抑制了MGC-803細胞中CD14的表達。

2.4 CD14對胃癌細胞侵襲能力的影響

Transwell檢測細胞侵襲能力，每組選擇5個視野，計數(shù)侵襲至膜下的細胞數(shù)目，取均數(shù)，結(jié)果CD14-shRNA組細胞侵襲數(shù)(107±9)個顯著低于對照組的(131±8)個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，表明CD14影響了胃癌細胞的侵襲(圖5)。

圖 1 CD14-shRNA載體插入部分測序圖Fig. 1 Sequencing map of the insert part of CD14-shRNA vectors

圖 2 細胞轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡觀察Fig. 2 Transfected cells under fluorescent microscopy

圖 3 RT-PCR檢測CD14 mRNA的表達Fig. 3 Expression of CD14 mRNA detected by RT-PCR (, n=3)

圖 4 Western blot檢測CD14蛋白的表達Fig. 4 Expression of CD14 protein detected by Western blot (, n=3)

圖 5 Transwell檢測細胞侵襲能力Fig. 5 Cell invasion detected by Transwell (, n=3)

3 討 論

CD14基因位于人5號染色體的長臂，編碼一段含有375個氨基酸殘基的多肽［5］。CD14具有兩種存在形式，即膜結(jié)合型(mCD14)和可溶型(sCD14)。mCD14為單核-巨噬細胞的表面分化抗原，因能夠與LPS-LBP結(jié)合而被認(rèn)為是LPS的高親和受體［6］。LPS為幽門螺桿菌等革蘭陰性菌的主要毒性物質(zhì)，能夠與多種蛋白結(jié)合引發(fā)機體的炎性反應(yīng)，因此，CD14在病菌感染及介導(dǎo)炎性反應(yīng)中發(fā)揮了重要的作用。近年來有報道指出，CD14啟動子區(qū)的多態(tài)性與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［7］，推測其原因可能是CD14啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的改變影響了CD14的表達。

本實驗室根據(jù)shRNA的設(shè)計原則分別位于轉(zhuǎn)錄起始位點后的第574、794和898 bp以及1 216 bp處設(shè)計了4條CD14-shRNA序列，并將其中1條序列打亂作為陰性對照，經(jīng)NCBI的Blast檢索以確保序列的特異性。將合成寡核苷酸退火合成雙鏈后連接入帶有GFP熒光標(biāo)記的干擾載體pGCsi-H1/Neo/GFP，測序結(jié)果與預(yù)期一致，表明CD14干擾載體構(gòu)建成功。pGCsi-H1/ Neo/GFP載體不僅具有新霉素篩選標(biāo)記還帶有綠色熒光蛋白標(biāo)記，能夠在細胞轉(zhuǎn)染中通過觀察發(fā)出綠色熒光細胞的數(shù)目檢測轉(zhuǎn)染效率。經(jīng)過4周的篩選，鏡下已可以觀察到90%以上的細胞發(fā)出了綠色熒光，表明已得到了CD14-shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的胃癌細胞系。經(jīng)過檢測位于898 bp處的CD14-shRNA-3轉(zhuǎn)染組CD14 mRNA和蛋白的相對表達量分別降低了71.7%和63.4%，表明本研究已經(jīng)成功篩選得到了CD14穩(wěn)定低表達的胃癌細胞系，為研究CD14與胃癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系提供了良好的細胞模型。

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最普遍的生物學(xué)特征，也是影響患者生存和預(yù)后的關(guān)鍵因素，胃癌不僅發(fā)病率高且在中晚期極易發(fā)生轉(zhuǎn)移，成為治療失敗的主要原因。目前，有關(guān)CD14與細胞侵襲及遷移有關(guān)的報道較少，Mina等［8］以CD14過表達細胞培養(yǎng)上清液作為趨化因子干預(yù)人臍靜脈內(nèi)皮細胞，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞的遷移能力顯著增強，Dong等［9］在侵襲能力較強的前列腺癌細胞株P(guān)C3中發(fā)現(xiàn)TLR4以及CD14、MD等蛋白的表達升高，提示CD14/TLR4通路與癌細胞的侵襲能力呈正相關(guān)。本研究中CD14穩(wěn)定沉默細胞株的侵襲能力顯著低于對照組，進一步表明CD14在介導(dǎo)腫瘤細胞侵襲及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用，但其詳細的作用機制還有待于進一步探討。

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The research on the construction of gastric cancer cells with CD14 silencing and it's invasion ability

LI Kang, DAN Zeng, WANG Zhong-hua, DE Ji, CHEN Xiao-hong, LIU Ming-hua (Department of Gastroenterology, People’s Hospital of Tibet Autonomous Region, Lhasa Tibet 850000, China)

LI Kang E-mail: likang820@yahoo.com.cn

Background and purpose: Cluster of differentiation antigen 14(CD14), a high-affinity receptor for the lipopolysaccharide (LPS), could identify the gram-negative bacteria, fungi and mycobacterium tuberculosis, and mediate the inflammatory response of infected body, which is the first step in bacteria induced signal transduction. Expression of CD14 often turned to be abnormal in the tumor tissue and cancer cells. Recent studies have observed that functional CD14 polymorphisms, especially in the promoter motifs, are associated with a higher risk of H.pylori-related gastric carcinoma, indicated that CD14 is closely associated with the development of gastric cancer. This study aimed to construct CD14-shRNA expression vector and gastric cancer cells with CD14 silencing and to discuss the influence of CD14 on the invasion ability of gastric cancer cells and to lay a experimental basis for the study of the pathogenesis of gastric cancer. Methods: Four CD14-shRNA sequences were synthesized and CD14-shRNA expression vector was constructed to transfect cells and gastric cancer cells with CD14 silencing were screened by G418. RT-PCR and Western blot was used to detect the CD14 mRNA and protein level. The invasion ability of gastric cancer cells was detected by Transwell chamber. Results: CD14-shRNA expression vector was successfully constructed and screened to obtain gastric cancer cells with CD14 silencing, of which the CD14 mRNA and protein silencing efficiency were 71.7% and 63.4% respectively. Compared with the control group, the invasion ability of CD14-shRNA group was decreased obviously with statistical differences (P＜0.01). Conclusion: Gastric cancer cells with CD14 silencing are constructed successfully and the influence of CD14 on the invasion ability of gastric cancer cells is preliminarily confirmed.

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.04.003

R735.2

：A

：1007-3639(2013)04-0254-06

2013-01-21

2013-04-04）

國家自然科學(xué)基金資助項目(No: 81060165)。

李康 E-mail:likang820@yahoo.com.cn