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        白介素8的3種亞型對卵巢癌SKOV3細(xì)胞生物學(xué)活性的影響

        2013-06-09 15:38:34
        中國癌癥雜志 2013年4期
        關(guān)鍵詞:生長能力

        廣西醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院婦瘤科,廣西區(qū)域高發(fā)腫瘤重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 南寧530021

        白介素8的3種亞型對卵巢癌SKOV3細(xì)胞生物學(xué)活性的影響

        王愛萍 王琪 張瑋 尹巧云 李力

        廣西醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院婦瘤科,廣西區(qū)域高發(fā)腫瘤重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 南寧530021

        背景與目的:卵巢癌的進(jìn)展是一種多因素、多環(huán)節(jié)、多階段的過程,近來研究表明卵巢癌患者白介素8(IL-8)水平顯著高于良性腫瘤患者及健康人群,卵巢癌的生長和轉(zhuǎn)移可能與過度表達(dá)的IL-8有關(guān),但尚無報(bào)道表明IL-8主要亞型在卵巢癌中的作用。本研究探討IL-8的3種亞型IL-8(1-77)、IL-8(5-77)和IL-8(9-77)對卵巢癌SKOV3細(xì)胞的增殖、生長、遷移和侵襲能力的影響及其作用機(jī)理。方法:確認(rèn)分別獲得IL-8的3種亞型穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SKOV3細(xì)胞后,應(yīng)用MTT比色測定法比較各細(xì)胞的生長曲線;采用流式細(xì)胞儀比較各細(xì)胞的細(xì)胞生長周期;采用集落形成實(shí)驗(yàn)比較各組細(xì)胞的克隆率;運(yùn)用Transwell小室比較各細(xì)胞體外遷移和侵襲能力。結(jié)果:IL-8(1-77)-pwpi-SKOV3細(xì)胞和IL-8(5-77)-pwpi-SKOV3在G2期的比率明顯高于SKOV3(P=0.017,P=0.020);IL-8(1-77)-pwpi-SKOV3和IL-8(5-77)-pwpi-SKOV3細(xì)胞克隆率明顯高于SKOV3(P=0.000,P=0.001),IL-8(9-77)-pwpi-SKOV3細(xì)胞克隆率明顯低于SKOV3(P=0.013);細(xì)胞體外遷移能力多組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但細(xì)胞體外侵襲能力IL-8(1-77)-pwpi-SKOV3和IL-8(5-77)-pwpi-SKOV3明顯強(qiáng)于SKOV3(P=0.000,P=0.002),IL-8(9-77)-pwpi-SKOV3明顯弱于SKOV3(P=0.067)。結(jié)論:IL-8(1-77)和IL-8(5-77)可能促進(jìn)卵巢癌SKOV3細(xì)胞的生長和增殖,并增強(qiáng)其侵襲能力,而IL-8(9-77)對卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖可能有抑制作用。

        卵巢上皮癌;IL-8亞型;生物學(xué)功能

        目前的研究認(rèn)為,IL-8對腫瘤的發(fā)生具有雙向性,一方面通過調(diào)節(jié)金屬蛋白酶促進(jìn)血管生成等刺激腫瘤生長[1-2]; 另一方面則趨化中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞到腫瘤部位抑制腫瘤生長[3]。這種看似矛盾的結(jié)果,提示在不同環(huán)境、誘導(dǎo)劑作用下產(chǎn)生的IL-8的亞型可能是不同的,而不同亞型的IL-8在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也可能發(fā)揮著不同的作用。本組前期研究采用免疫芯片PS20結(jié)合蛋白質(zhì)芯片飛行質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)技術(shù)檢測卵巢癌患者與良性腫瘤患者及健康人群血清中不同亞型IL-8表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),卵巢良性腫瘤患者的IL-8(1-77)亞型表達(dá)顯著高于惡性腫瘤患者(P<0.01),惡性腫瘤患者血清中IL-8(9-77)和IL-8(5-77)亞型含量比良性腫瘤患者顯著升高(P<0.01);早期腫瘤患者IL-8(1-77)亞型表達(dá)顯著高于晚期腫瘤患者,IL-8(9-77)和IL-8(5-77)亞型卻與之相反[4]。本實(shí)驗(yàn)先期已成功將IL-8 3種亞型IL-8(1-77)、IL-8(5-77)、IL-8(9-77)轉(zhuǎn)染至無IL-8蛋白表達(dá)的卵巢癌SKOV3細(xì)胞株中[5]。因?yàn)轶w外培養(yǎng)的卵巢癌細(xì)胞不分泌IL-8[6],為了探討IL-8亞型對卵巢癌的作用機(jī)理,我們選取無IL-8蛋白表達(dá)的卵巢癌SKOV3細(xì)胞作為轉(zhuǎn)染對象,分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)入IL-8(1-77)、IL-8(5-77)、IL-8(9-77)3種亞型,應(yīng)用MTT法、流式細(xì)胞儀、Transwell小室法等方法比較IL-8的3種亞型對卵巢癌SKOV3細(xì)胞株的增殖、生長、遷移和侵襲能力的影響,為臨床診斷和治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

        1 材料和方法

        1.1 材料

        卵巢癌SKOV3細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所,由本實(shí)驗(yàn)室保存。IL-8(1-77)-pwpi-SKOV3細(xì)胞、IL-8(5-77)-pwpi-SKOV3細(xì)胞、IL-8(9-77)-pwpi-SKOV3細(xì)胞和pwpi-SKOV3細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室前期分別轉(zhuǎn)染并過表達(dá)IL-8(1-77)、IL-8(5-77)、IL-8(9-77)和pwpi的SKOV3細(xì)胞。RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清、胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、Matrigel膠購于北京大學(xué)生物中心,Tanswell小室購于美國Corning Costar公司。

        1.2 方法

        1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組

        每次實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組即IL-8(1-77)-pwpi-SKOV3細(xì)胞、IL-8(5-77)-pwpi-SKOV3細(xì)胞和IL-8(9-77)-pwpi-SKOV3,同時(shí)設(shè)SKOV3細(xì)胞和pwpi-SKOV3細(xì)胞為對照組,共5組細(xì)胞,每組平行設(shè)3組重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

        1.2.2 細(xì)胞生長曲線測定

        采用MTT法,將5組細(xì)胞接種于48孔板中,每種細(xì)胞設(shè)21孔,24 h后每組細(xì)胞每天任意挑選3個(gè)孔加入MTT 20 μL溫育4 h,棄上清液加入DMSO 150 μL,吹打混勻使甲臜充分溶解,將所有溶液移至另一96孔板;酶標(biāo)儀比色(波長492 nm),連測7d吸光度值(A492),并繪制生長曲線。

        1.2.3 細(xì)胞生長周期測定

        采用流式細(xì)胞儀法測定細(xì)胞周期:培養(yǎng)好的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化,PBS洗滌細(xì)胞2次后加入2 mL預(yù)冷的70%乙醇,4 ℃固定過夜。次日將細(xì)胞取出再次用PBS洗滌2次,留取500 μL,細(xì)胞數(shù)約5×105,加Triton-X-100 10 μL,RNase 1 μL,混勻約30 min后加PI(濃度為50 μg/ mL)5 μL,避光染色30 min后300目篩網(wǎng)過濾后放入流式細(xì)胞儀檢測。

        1.2.4 細(xì)胞克隆率測定

        采用集落形成實(shí)驗(yàn),將5組細(xì)胞按照每孔100、200、400個(gè)細(xì)胞的密度接種于24孔板(每種密度做3個(gè)復(fù)孔),7d后姬姆薩染色照相,計(jì)數(shù)各組細(xì)胞的集落數(shù),比較各組細(xì)胞的克隆率。

        1.2.5 細(xì)胞體外遷移能力測定

        采用Transwell小室法,具體操作參照Transwell說明書進(jìn)行;20~20 h后用MTT法分別檢測上、下室細(xì)胞的A值,計(jì)算遷移率:A遷移細(xì)胞=A下表面細(xì)胞/A上表面細(xì)胞。

        1.2.6 細(xì)胞體外侵襲能力測定

        采用Transwell-Matrigel膠法,Transwell小室上室先鋪膠,加入Matrigel膠50 μL (1.25 mg/mL),然后參照Transwell說明書進(jìn)行,培養(yǎng)20~24 h后用MTT法分別檢測上、下室細(xì)胞的A值,計(jì)算侵襲率:A侵襲細(xì)胞=A下表面細(xì)胞/

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        數(shù)據(jù)使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理,細(xì)胞的生長曲線采用重復(fù)測量的方差分析,細(xì)胞的生長周期、集落形成實(shí)驗(yàn)、遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)均采用方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié) 果

        2.1 細(xì)胞生長曲線

        pwpi-SKOV3與SKOV3細(xì)胞相比,生長計(jì)數(shù)均值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.762),而IL-8(1-77)-pwpi-SKOV3和IL-8(5-77)-pwpi-SKOV3細(xì)胞生長速度明顯快于SKOV3細(xì)胞,生長計(jì)數(shù)均值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000),表明IL-8(1-77)和IL-8(5-77)的過表達(dá)對SKOV3細(xì)胞的生長具有促進(jìn)作用。而IL-8(9-77)-pwpi-SKOV3細(xì)胞生長速度明顯慢于SKOV3細(xì)胞,生長計(jì)數(shù)均值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001,圖1)。

        2.2 細(xì)胞生長周期

        流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示,IL-8(1-77)-pwpi-SKOV3和IL-8(5-77)-pwpi-SKOV3在G2期的比率明顯高于SKOV3,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.017和0.020);其他細(xì)胞生長周期差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05;表1,圖2)。

        2.3 細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)

        細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,IL-8(1-77)-pwpi-SKOV3和IL-8(5-77)-pwpi-SKOV3細(xì)胞克隆率明顯高于SKOV3,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000和0.001),IL-8(9-77)-pwpi-SKOV3細(xì)胞克隆率明顯低于SKOV3(P=0.013,表2,圖3)。

        圖 1 5組細(xì)胞的生長曲線圖Fig. 1 The growth curves of the 5 groups of cells

        表 1 5組細(xì)胞的細(xì)胞生長周期Tab. 1 The cell cycle of the 5 groups of cells

        表 2 5組細(xì)胞的克隆形成率Tab. 2 The cells cloning formation rate of the 5 groups

        2.4 細(xì)胞體外遷移能力

        IL-8(1-77)-pwpi-SKOV3、IL-8(5-77)-pwpi-SKOV3、IL-8(9-77)-pwpi-SKOV3、pwpi-SKOV3和SKOV3之間Transwell小室上、下表面細(xì)胞的A值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,表3)。

        表 3 5組細(xì)胞的體外遷移能力Tab. 3 Migration capability of the 5 groups of cells in vitro ()

        表 3 5組細(xì)胞的體外遷移能力Tab. 3 Migration capability of the 5 groups of cells in vitro ()

        *: Comparison of each group with SKOV3group;△: Compared with each group..

        GroupLower surface/upper surfaceP*IL-8(1-77)-pwpi-SKOV30.354±0.0200.919 IL-8(5-77)-pwpi-SKOV30.348±0.0130.684 IL-8(9-77)-pwpi-SKOV30.356±0.015 0.814 pwpi-SKOV30.351±0.0230.897 SKOV30.371±0.0140.857△

        2.5 細(xì)胞體外侵襲能力

        IL-8(1-77)-pwpi-SKOV3和IL-8(5-77)-pwpi-SKOV3細(xì)胞侵襲能力明顯強(qiáng)于SKOV3,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000和0.002),IL-8(9-77)-pwpi-SKOV3明顯弱于SKOV3(P=0.067,表4,圖4)。

        圖 2 5 組細(xì)胞的細(xì)胞生長周期圖Fig. 2 The cell growth cycle diagram of the 5 groups of cells

        圖 3 接種細(xì)胞為200個(gè)時(shí)的細(xì)胞集落形成圖Fig. 3 The cell colony formation diagram were when inoculated cell number to be 200

        圖 4 5 組細(xì)胞體外侵襲圖Fig. 4 Invading capability of the 5 groups of cells in vitro

        表 4 5組細(xì)胞的體外侵襲能力Tab. 4 Invading capability of the 5 groups of cells in vitro ()

        表 4 5組細(xì)胞的體外侵襲能力Tab. 4 Invading capability of the 5 groups of cells in vitro ()

        *: Comparison of each group with SKOV3group;△: Compared with each group.

        GroupLower surface/upper surfaceP*IL-8(1-77)-pwpi-SKOV30.150±0.0260.000 IL-8(5-77)-pwpi-SKOV30.141±0.0140.002 IL-8(9-77)-pwpi-SKOV30.093±0.016 0.067 pwpi-SKOV30.102±0.0100.986 SKOV30.117±0.0040.004△

        3 討 論

        卵巢癌是女性常見的惡性腫瘤之一,由于卵巢位于盆腔深部,早期病變不易發(fā)現(xiàn),一旦出現(xiàn)癥狀多屬晚期。近年來,理想的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)和鉑類為主的化療方案的應(yīng)用,使卵巢癌的治療效果有了明顯提高,但5年生存率僅為30%~40%[7],病死率居?jì)D科惡性腫瘤首位,主要原因與70%的患者在就診時(shí)已屬晚期,治療后70%的患者將會(huì)復(fù)發(fā)有關(guān)。因此,尋找診斷和治療手段是目前卵巢癌研究的重點(diǎn)。

        本課題組在前期利用蛋白組學(xué)技術(shù)篩選鑒定和驗(yàn)證新的潛在的卵巢上皮癌血清標(biāo)志物時(shí),發(fā)現(xiàn)血清IL-8可以作為卵巢上皮癌的標(biāo)志物,但不同亞型的IL-8卵巢上皮癌血清中的含量并不一致[4]。IL-8屬于趨化因子,成熟的IL-8分子由蛋白酶水解的不同可裂解成以下7鏈:MDNCF-a 、IL-8(1-77)、IL-8(5-77)、IL-8(6-77)、IL-8(7-77)、IL-8(8-77)、IL-8(9-77)。這些亞型都具有生物學(xué)活性,但不同亞型的IL-8在誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的趨化和脫顆粒的能力不同[8]。IL-8各亞型在人類卵巢腫瘤生長的作用以前研究得很少。為了更好地了解IL-8各亞型在卵巢腫瘤中的作用,本課題組先期已成功構(gòu)建小分子蛋白慢病毒表達(dá)系統(tǒng),并將IL-8的3種亞型IL-8(1-77)、IL-8(5-77)、IL-8(9-77)轉(zhuǎn)染至無IL-8蛋白表達(dá)的卵巢癌SKOV3細(xì)胞株中,研究其對卵巢癌細(xì)胞功能的影響。我們的數(shù)據(jù)表明,IL-8亞型IL-8(1-77)和IL-8(5-77)能促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞SKOV3的生長和增殖,并增強(qiáng)其侵襲能力,而IL-8(9-77)對SKOV3細(xì)胞增殖有抑制作用。雖然對于IL-8(5-77)報(bào)道較少,但在IL-8亞型中,IL-8(5-77)與IL-8(6-77)的功能相似,兩者同屬于中性粒細(xì)胞激化因子1III型。本課題組前期研究表明[9],IL-8(1-77)在惡性和良性卵巢腫瘤細(xì)胞中表達(dá),但在正常卵巢細(xì)胞中不表達(dá);L-8(6-77)在惡性卵巢腫瘤細(xì)胞中表達(dá),在良性腫瘤和健康人群樣本中不表達(dá);IL-8(9-77)在卵巢惡性腫瘤細(xì)胞及良性腫瘤或正常卵巢細(xì)胞中均不表達(dá)。這些研究結(jié)果顯示,在不同的環(huán)境、誘導(dǎo)劑作用下,IL-8各亞型對卵巢惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)揮不同的調(diào)節(jié)功能。

        Mortier等[10]的研究結(jié)果顯示,IL-8多種亞型在誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞外滲方面的作用可分為3類:第1類IL-8通過氨肽酶裂解而成,包含75至79個(gè)氨基酸形式,具有中度誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞外滲能力;第2類通過蛋白水解生成(如絲氨酸蛋白酶),包含69至72個(gè)氨基酸的形式,能夠非常有力地誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞外滲;第3類是通過肽?;彼崦搧啺泵赴丫彼岚被┒诵薷某晒习彼幔形⑷跽T導(dǎo)中性粒細(xì)胞外滲能力。而Clark-Lewis等[11]的研究顯示,IL-8的亞型對中性粒細(xì)胞的趨化活性較短的形式比全長的形式活躍。結(jié)合此結(jié)果,我們可以推斷IL-8(1-77)、IL-8(5-77)、IL-8(9-77)對于腫瘤細(xì)胞的增長活性呈逐步下降的趨勢,甚至IL-8(9-77)對腫瘤的生長有抑制作用。這和本研究結(jié)果相一致。

        Galligan等[12]研究表明,IL-8能夠促進(jìn)堿性磷酸酶、過氧化物酶、超氧陰離子自由基的釋放,而在牛的炎性反應(yīng)過程中發(fā)揮中性粒細(xì)胞聚集和活化,劑量低時(shí)無明顯的增強(qiáng)牛細(xì)胞遷移能力,而兩亞型劑量越高,其對牛細(xì)胞遷移能力越強(qiáng),IL-8(6-77)與IL-8(1-77)兩種亞型之間的遷移能力無差別。Lee等[6]應(yīng)用IL-8轉(zhuǎn)染的卵巢細(xì)胞株進(jìn)行體外侵襲和遷移實(shí)驗(yàn),探討IL-8是否能促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞株的侵襲和遷移,結(jié)果均為陰性。結(jié)合他們的研究結(jié)果,我們可以確定的是,IL-8及其亞型并不促進(jìn)卵巢腫瘤細(xì)胞的遷移,但各亞型對侵襲能力的影響有所不同,原因可能與IL-8能夠誘導(dǎo)新生血管生成有關(guān)[13-14]。

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        The impact of three subtypes of IL-8 on biological functions of ovarian cancer SKOV3cells

        WANG Ai-ping, WANG Qi, ZHANG Wei, YIN Qiao-yun, LI Li (Department of Gynecology Oncology, Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University and the Emphasis Lab of High Incidence Cancer in Guangxi Region, Nanning Guangxi 530021, China)

        LI Li E-mail: lili@gxmu.edu.cn

        Background and purpose: Ovarian cancer progression is a multistep process. Recent research shows that IL-8 level of ovarian cancer patients is significantly higher than that of patients with benign tumors and normal people, the growth and metastasis of ovarian cancer may be associated with over-expression of IL-8, but there is no report about the function of the main subtypes of IL-8 in ovarian cancer. The study was to investigate the influence of IL-8 three subtypes on ovarian cancer SKOV3cell proliferation, growth, migrating and invasive capability, and the underlying mechanism. Methods: After confirming obtaining SKOV3cell with three hypotypes IL-8(1-77), IL-8(5-77), IL-8(9-77) over-expression respectively, MTT colorimetric method was used to detect the growth cure of different cells; The flow cytometry was used to compare the cell cycle of different cells; The cell proliferation capability of different cells was tested by the cell body colony formation; Transwell closet was used to compare different cell body’s external migration and invasive capability. Results: IL-8(1-77)-pwpi-SKOV3and IL-8(5-77)-pwpi-SKOV3cells in the ratio of G2phase were significantly higher than that of SKOV3cells (P=0.017 and 0.020). The cloning formation rate of IL-8(1-77)-pwpi-SKOV3and IL-8 (5-77) -pwpi-SKOV3cells were significantly higher than that of SKOV3cells (P=0.000 and 0.001), IL-8 (9-77)-pwpi-SKOV3cells was significantly lower than SKOV3cells (P=0.013); the migration ability in vitro of different groups of cells had no statistically significant differences (P>0.05), but the invasion ability invitro of IL-8( 1-77 )-pwpi-SKOV3and IL-8 (5-77) -pwpi-SKOV3cells were significantly stronger than that of SKOV3cells(P=0.000 and 0.002), IL-8 (9-77) -pwpi-SKOV3cells was significantly weaker than that of SKOV3cells(P=0.067).. Conclusion: The subtypes of IL-8 (1-77) and IL-8 (5-77) can promote ovarian cancer SKOV3cell growth and proliferation, and enhance their invasive ability, while IL-8(9-77) inhibits proliferation of ovarian cancer SKOV3cells.

        Ovarian cancer; IL-8 subtype; Biological functions

        10.3969/j.issn.1007-3969.2013.04.002

        R737.31

        :A

        :1007-3639(2013)04-0248-06

        2012-12-03

        2013-02-01)

        國家自然科學(xué)基金(No:30760266)。

        李力 E-mail:lili@gxmu.edu.cn

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