高雯臧榮余王雁楊麗娜劉楊亓子豪尹勝楊恭

1.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海200032；

2.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究中心，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海200032

人類輸卵管上皮永生化細(xì)胞系的建立及鑒定

高雯1,2臧榮余1王雁2楊麗娜2劉楊1亓子豪2尹勝1楊恭2

1.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海200032；

2.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究中心，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海200032

背景與目的：最近研究表明卵巢高級(jí)別漿液性癌可能起源于輸卵管上皮。本課題通過基因沉默和端粒酶導(dǎo)入技術(shù)將原代輸卵管上皮細(xì)胞永生化，為以后建立惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞系和卵巢癌動(dòng)物模型奠定基礎(chǔ)。方法：分離并培養(yǎng)輸卵管上皮細(xì)胞，導(dǎo)入p53和pRb shRNA結(jié)合hTERTcDNA，建立p53和pRb基因同時(shí)沉默并過表達(dá)hTERT的永生化細(xì)胞系，并對(duì)永生化細(xì)胞系進(jìn)行連續(xù)傳代、沉默基因的蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)測(cè)定、SA-β-gal染色和非停泊生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)致瘤活性鑒定。結(jié)果：我們建立了穩(wěn)定表達(dá)p53、pRbshRNA和hTERT的永生化輸卵管上皮細(xì)胞系：FTE248116/p53i+pRbi+hTERT及FTE312249/p53i+pRbi+hTERT。結(jié)論：可以通過導(dǎo)入端粒酶基因及敲除抑癌基因p53和pRb來建立永生化細(xì)胞系,并有望于構(gòu)建惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞系和人類高級(jí)別漿液性卵巢癌動(dòng)物模型。

輸卵管上皮細(xì)胞；p53；pRb；hTERT；永生化

卵巢癌(ovarian cancer)是致死率最高的婦科惡性腫瘤。在原發(fā)性卵巢癌中，75%～90%是上皮性癌。目前越來越多的證據(jù)表明：高級(jí)別漿液性卵巢上皮性癌起源于輸卵管上皮，卵巢只是繼發(fā)受累。無論從形態(tài)學(xué)分析還是經(jīng)過蛋白組學(xué)分析都證實(shí)高級(jí)別漿液性卵巢癌起源于輸卵管上皮［1］。正常上皮細(xì)胞在體外連續(xù)傳代6～15次后出現(xiàn)生長(zhǎng)阻滯、復(fù)制危機(jī)乃至衰老死亡，而癌變細(xì)胞的最大特性卻是永生不老［2］。細(xì)胞永生化是細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的必經(jīng)階段。所謂的“永生化” 是指培養(yǎng)細(xì)胞在體外能穩(wěn)定傳代、生長(zhǎng)，但又不發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，即不具有癌細(xì)胞的特征，這有助于體外研究［3］。抑癌基因p53和pRb的失活是人體細(xì)胞獲得永生化的必要條件［4-6］。為了克服細(xì)胞分裂過程中端?？s短現(xiàn)象，在正常細(xì)胞中導(dǎo)入端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶催化亞基基因(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)是目前用于維持端粒結(jié)構(gòu)完整和穩(wěn)定的最有效途徑，可防止細(xì)胞復(fù)制性衰老，使正常上皮細(xì)胞永生化［7-9］。因此，本課題用shRNA沉默p53和pRb基因表達(dá)，并結(jié)合hTERT轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法建立永生化的人類輸卵管上皮(fallopian tube epithelia，F(xiàn)TE)細(xì)胞系。

1 材料和方法

1.1 組織來源

選取復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2011年手術(shù)切除標(biāo)本：宮頸癌Ia期的輸卵管組織，經(jīng)病理證實(shí)輸卵管正常。

1.2 主要試劑

細(xì)胞培養(yǎng)液：培養(yǎng)正常人類卵巢表面上皮細(xì)胞是用MCDB培養(yǎng)液和 M199培養(yǎng)液以1∶1混合，加入10%～20%的胎牛血清，20 ng/mL的上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor, EGF)和1%的青霉素及鏈霉素。研究表明MCDB不僅能促進(jìn)正常人類卵巢表面上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)潛能，而且能維持其上皮表型。

胰酶2.5% trypsin購(gòu)自Gibco公司。胎牛血清購(gòu)自Gibco公司。MTT粉購(gòu)自Sigma公司。雙抗購(gòu)自Biowest 公司。GENMED細(xì)胞衰老特異性β-半乳糖苷酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海杰美醫(yī)藥科技有限公司。低熔點(diǎn)瓊脂糖購(gòu)自Biowest。CK-7/17 (628701，按1∶1 000稀釋)購(gòu)自Biolgend公司；E-cadherin(BD 6101820，按1∶2 000稀釋)購(gòu)自BD公司；pRb抗體購(gòu)自(G3-245，按1∶2 000稀釋)購(gòu)自BD公司；p53抗體(sc-1261，按1∶1 000稀釋)購(gòu)自Santa cruz公司；β-actin(A5441，1∶2 000)購(gòu)自Sigma公司。hTERT(sc-7212，按1∶1 000稀釋)購(gòu)自Santa cruz公司。對(duì)照卵巢癌細(xì)胞系SKOV3 購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心完成，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)自BK公司。

1.3 正常輸卵管上皮細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

用無菌手術(shù)刀片切取輸卵管標(biāo)本后，立即放入無菌細(xì)胞培養(yǎng)皿中并將培養(yǎng)皿置于冰上，拿到原代細(xì)胞培養(yǎng)房?jī)?nèi)，此過程不超過15 min。然后在生物安全柜內(nèi)操作，保證整個(gè)過程都無菌：將組織塊用無菌鑷子移到一個(gè)新的細(xì)胞培養(yǎng)皿，用加入10% 雙抗的PBS溫和的清洗表層上皮3次，每次5 min，然后用培養(yǎng)基清洗1次，洗過之后將培養(yǎng)基吸掉，加入新鮮培養(yǎng)基，用無菌手術(shù)刀片溫和地刮輸卵管的表面細(xì)胞，也可用刀背鈍性刮取。直到把整個(gè)組織塊刮到非常小不能再刮取為止。將培養(yǎng)皿放到37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的溫箱進(jìn)行培養(yǎng)。3 d之后更換培養(yǎng)基，一般經(jīng)過5～6 d可以看到明顯的貼壁細(xì)胞，以后每2 d觀察1次細(xì)胞，隔3 d更換1次培養(yǎng)基。在正常情況下，14 d后，細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿。當(dāng)細(xì)胞密度長(zhǎng)到80%～90%時(shí)，用胰酶消化并以1∶3進(jìn)行細(xì)胞傳代。如果上皮細(xì)胞中參雜有間質(zhì)細(xì)胞，可以采用以下方法移除：將培養(yǎng)基吸棄，加入PBS溫和地沖洗2次，加入0.5 mL 0.05%的胰酶在培養(yǎng)皿中，左右搖晃使胰酶鋪平培養(yǎng)皿的底部，然后在顯微鏡下持續(xù)觀察，大約60 s后，成纖維細(xì)胞脫離皿的底部而上皮細(xì)胞仍然貼壁，此時(shí)立即用培養(yǎng)基中和，從而將上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分開，上皮細(xì)胞傳代2～3次就可以得到純化的上皮細(xì)胞。

1.4 檢測(cè)細(xì)胞的上皮起源

顯微鏡下觀察培養(yǎng)的輸卵管上皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。并用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)上皮性標(biāo)志：CK 7/17和E-cadherin。

1.5 以逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的方式導(dǎo)入永生化相關(guān)基因

1.5.1 p53i+ pRbi +hTRER載體的構(gòu)建

p53 shRNA構(gòu)建:根據(jù)cDNA序列設(shè)計(jì)2對(duì)shRNA引物P1:5’GCAGTCACAGCA CATGACGTTCAAGAGACGTCATGTG CTGTGACTGCCCTTTTTG-3’；P2:5’AA TTCAAAAAGGGCAGTCACAGCACAT GACGTCTCTTGAACGTCATGTGCTGTGACT GCC-3’；pRb shRNA構(gòu)建:根據(jù)cDNA序列設(shè)計(jì)2對(duì)shRNA引物P1:5’-GGAGAAAGTTTCATCTGTGGACTACGTA CTCCACAGATGAAACTTTCTCCCTTTTTG-3’；P2:5’-AATTCAAAAAGGGAGAAAGTTTCATCTG TGGAGTACGTAGTCCACAGATGAAAC TTTCTCC-3’；pBabe-hTERT/hygromycin由Dr Robert Weinberg惠贈(zèng)，將cDNA片段酶切下來再與pBabe/p53siRNA+pRbsiRNA連接，經(jīng)測(cè)序鑒定后，成功購(gòu)建質(zhì)粒pBabe/ p53siRNA+pRbsiRNA+hTERT(圖1)。

圖 1 反轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒pBabe/p53siRNA+pRbsiRNA+hTERT結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 1 Schematic overview of retroviral vector plasmid pBabe/p53siRNA+pRbsiRNA+hTERT

1.5.2 轉(zhuǎn)染phoenix 病毒包裝細(xì)胞

轉(zhuǎn)染前 1 d，將phoenix細(xì)胞按1∶3密度傳代于2個(gè)6 cm培養(yǎng)皿中，24 h后待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時(shí)即可用于轉(zhuǎn)染。2個(gè)培養(yǎng)皿分別用于轉(zhuǎn)染EGFP熒光質(zhì)粒和p53i+pRbi+hTERT質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染采用磷酸鈣法：質(zhì)粒20 μg，H2O 450 μL，2.5 mol/L CaCl250 μL，2×HBS (pH為7.0) 500 μL，混勻后加到培養(yǎng)液中，細(xì)胞放于32 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫箱進(jìn)行培養(yǎng)。分別于12、24 h后換新鮮培養(yǎng)液4 mL，然后分別于轉(zhuǎn)染后 48、96 h收集病毒。

1.5.3 病毒的收獲

收集轉(zhuǎn)染后48 h的細(xì)胞上清液，4 ℃，1 200×g離心5 min除去細(xì)胞碎片，用0.45 μm濾器過濾上清液于1.5 mL無菌EP管中，封口，于-80 ℃條件下備用。

1.5.4 感染正常輸卵管表面上皮細(xì)胞

收獲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期正常輸卵管上皮細(xì)胞, 細(xì)胞按 1∶3 密度消化傳代于2個(gè) 6 cm培養(yǎng)皿中，37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫箱培養(yǎng) 24 h，細(xì)胞貼壁后感染p53i+pRbi+hTERT病毒。吸去培養(yǎng)基，加入 3 mL新鮮培養(yǎng)基、1 mL病毒液和10 μL(4 μg/μL)polybrene輕輕混勻，32 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫箱培養(yǎng) 48 h后換液，加強(qiáng)感染1次，感染48 h后, 按 1∶4 持續(xù)傳代，進(jìn)行自然篩選。

1.6 永生化上皮細(xì)胞的鑒定

通過轉(zhuǎn)入p53和pRb的shRNA結(jié)合hTERTcDNA的辦法，建立p53和pRb基因同時(shí)沉默并過表達(dá)hTERT的永生化細(xì)胞系。建立的永生化細(xì)胞系為：FTE248116/p53i+pRbi+hTERT及FTE312249/p53i+pRbi+hTERT。并通過以下方法對(duì)上述2個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行鑒定。

1.6.1 外源基因在細(xì)胞中沉默及過表達(dá)的情況

蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)細(xì)胞總蛋白的提取通過RIPA裂解液，按照BCA試劑盒的操作步驟進(jìn)行蛋白定量，Western blot的上樣量為20 μg。進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳，電泳后含目的蛋白的膠電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉，于室溫封閉3 h將封閉后的 PVDF 膜置入TBST適當(dāng)稀釋的一抗溶液中，4 ℃緩慢搖動(dòng)過夜，室溫洗膜，將PVDF膜置入以TBST 1∶2 000稀釋的的二抗(羊抗鼠及羊抗兔抗體)溶液中，于室溫反應(yīng)1 h。辣根過氧化物酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光液后，在ImageQuant LAS 4000化學(xué)發(fā)光成像分析儀中進(jìn)行曝光。

1.6.2 體外持續(xù)傳代的能力

取第一代生長(zhǎng)狀態(tài)良好細(xì)胞，持續(xù)傳代，記錄傳代天數(shù)，最后計(jì)算細(xì)胞的群體倍增時(shí)間。

1.6.3 衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶染色

在6孔板中培養(yǎng)細(xì)胞過夜，第2天待細(xì)胞密度達(dá)到50%～60%時(shí)，按照β-半乳糖苷酶試劑盒的說明書進(jìn)行染色，之后在顯微鏡下拍照。

1.6.4 非停泊生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)

雙層軟瓊脂培養(yǎng)，制備底層為1.4 %、上層為0.7%的低熔點(diǎn)瓊脂糖培養(yǎng)基的平皿，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)。每個(gè)6 cm平皿中接種10×105個(gè)細(xì)胞, 培養(yǎng)20～30 d，1周后補(bǔ)充上層膠。于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞集落的形成，并計(jì)算形成克隆的個(gè)數(shù)。

1.6.5 裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房完成，選用6 ～7周無胸腺裸鼠。實(shí)驗(yàn)分3組：FTE248116/p53i+pRbi+hTERT、FTE312249/ p53i+pRbi+hTERT及SKOV3。每組5只裸鼠，每只裸鼠接種兩個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)5×106個(gè)細(xì)胞。卵巢癌細(xì)胞系SKOV3作為陽性對(duì)照, 裸鼠飼養(yǎng)共觀察6個(gè)月。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞的形態(tài)及表型

原代輸卵管細(xì)胞培養(yǎng) 72 h，經(jīng)換液后, 可見少量貼壁細(xì)胞。為單個(gè)或幾個(gè)細(xì)胞的克隆，經(jīng)10 d左右長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿。此時(shí)貼壁細(xì)胞為圓形或離心即為第一代細(xì)胞，細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)迅速(圖2)。經(jīng)Western blot檢測(cè)原代的輸卵管上皮細(xì)胞高表達(dá)上皮標(biāo)志CK7及E-cadherin(圖3)。證明細(xì)胞系FTE248116、FTE312249是上皮細(xì)胞。永生化的細(xì)胞系FTE248116/p53i+pRbi+hTERT及FTE312249/ p53i+pRbi+hTERT 中也表達(dá)CK7及 E-cadherin，表明該永生化細(xì)胞系維持了正常的上皮表型。永生化細(xì)胞經(jīng)染色體核型分析是正常的二倍體核型，無異倍體的出現(xiàn)。

2.2 基因沉默的鑒定結(jié)果

Western blot結(jié)果顯示，永生化的細(xì)胞系FTE248116/p53i+pRbi+hTERT及FTE312249/ p53i+pRbi+hTERT低表達(dá)p53及pRb蛋白，表明這兩個(gè)基因在細(xì)胞內(nèi)被敲除。高表達(dá)hTERT蛋白，表明 hTERT已被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染入永生化細(xì)胞。永生化細(xì)胞端粒酶活性增強(qiáng)，延長(zhǎng)并維持了端粒的長(zhǎng)度，使細(xì)胞得以無限增殖(圖4)。

2.3 群體倍增時(shí)間

圖 2 細(xì)胞的形態(tài)特征Fig. 2 Morphological characteristics of cells (×40)

永生化細(xì)胞系：FTE248116/ p53i+pRbi+hTERT及FTE312249/ p53i+pRbi+hTERT 在體外已經(jīng)連續(xù)傳代100次以上，還可以繼續(xù)傳代下去。原代細(xì)胞在長(zhǎng)到60 d時(shí)逐漸衰老，進(jìn)入生長(zhǎng)停滯期。而永生化的細(xì)胞可以一直傳代下去，在第180天仍處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，說明永生化細(xì)胞具有無限增殖能力(圖5)。

圖 4 Western blot 檢測(cè)永生化細(xì)胞的基因沉默及過表達(dá)情況Fig. 4 Western blot of p53, pRb and hTERT protein in immortalized cell lines

2.4 衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶染色結(jié)果

原代細(xì)胞在第8代時(shí)，細(xì)胞擴(kuò)大變得扁平，β-半乳糖苷酶染色后藍(lán)染細(xì)胞增多。而永生化的細(xì)胞在第60代的時(shí)候細(xì)胞仍然增殖很快，衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶染色后藍(lán)染細(xì)胞很少。說明永生化細(xì)胞沒有發(fā)生衰老，可以持續(xù)傳代(圖6)。

2.5 非停泊生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞集落的形成即克隆的個(gè)數(shù)。永生化細(xì)胞系FTE248116/p53i+pRbi+hTERT及FTE312249/ p53i+pRbi+hTERT在非停泊生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)20 d后有克隆形成，而原代的細(xì)胞FTE248116及FTE312249在非停泊生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)30 d后仍然沒有克隆形成。說明永生化細(xì)胞在體外具有無限增殖的能力(圖7)。

2.5 裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果

裸鼠共飼養(yǎng)觀察6個(gè)月后仍沒有觀察到腫瘤形成，而對(duì)照組SKOV3在接種相同數(shù)量的細(xì)胞1周后均出現(xiàn)皮下移植瘤，提示永生化細(xì)胞系無致瘤性。

圖 5 原代細(xì)胞及對(duì)應(yīng)永生化細(xì)胞系體外培養(yǎng)180 d的生長(zhǎng)曲線Fig. 5 Growth curve of parental normal cells and corresponding immortalized lines in 180 days of culture

圖 7 非停泊生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)(軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn))Fig. 7 Anchorage-independent growth assay

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)通過導(dǎo)入p53和pRb shRNA結(jié)合hTERTcDNA的方法，建立p53和pRb基因同時(shí)沉默并過表達(dá)hTERT的永生化細(xì)胞系。建立的細(xì)胞系明顯延緩細(xì)胞的衰老并延長(zhǎng)了細(xì)胞的傳代次數(shù)，可以在體外穩(wěn)定傳代；而且維持了正常的上皮表型，染色體核型分析中沒有異倍體的出現(xiàn)及染色體斷裂現(xiàn)象，表明這是穩(wěn)定的正常人類永生化細(xì)胞系。在非停泊生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)中能形成克隆，但在體外沒有致瘤活性符合永生化細(xì)胞的特性。因此，本實(shí)驗(yàn)建立的是成功的永生化細(xì)胞系，可望用來建立轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。本課題研究的永生化輸卵管上皮細(xì)胞系的方法也可以用來永生化其他的上皮細(xì)胞，從而研究其他腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

目前越來越多的證據(jù)表明，卵巢上皮性癌起源于輸卵管上皮，卵巢只是繼發(fā)受累。世界上許多婦科腫瘤和病理科專家認(rèn)為卵巢高級(jí)別漿液性癌源于輸卵管上皮瘤，當(dāng)這些細(xì)胞惡變并擴(kuò)散到腹腔或卵巢后，很快形成典型的高級(jí)別漿液性卵巢癌［1］。之前很多研究都是基于卵巢癌細(xì)胞系來研究卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制［10］，本課題通過先建立永生化輸卵管細(xì)胞系，后經(jīng)過導(dǎo)入致癌基因或敲出抑癌基因，使細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，從而為探討卵巢漿液性癌新的發(fā)生機(jī)制提供依據(jù)。

以前建立的永生化及轉(zhuǎn)化細(xì)胞系經(jīng)常用到病毒成分比如SV40或E6/E7，本課題研究人員也曾用SV40 T/t抗原結(jié)合hTERT成功建立了卵巢癌永生化細(xì)胞系［11］。然而自然發(fā)生的卵巢癌組織中并無猴病毒SV40大T抗原的存在，而且由于SV40大T抗原可以使p53、pRb、PP2A、p300等抑癌蛋白或一些未知蛋白喪失正常功能，因而用SV40大T抗原建立永生化的人類OSE細(xì)胞系的研究工作已逐漸被放棄［12］。如何用非病毒成分的手段建立永生化的上皮細(xì)胞系是很多科學(xué)家想要解決的問題。之前有報(bào)道用敲除p53基因同時(shí)導(dǎo)入hTERT基因的方法建立了永生化的卵巢上皮細(xì)胞系［13］。有研究人員只用導(dǎo)入hTERT基因的方法建立了永生化的卵巢上皮細(xì)胞系，維持了功能性p53和pRb的表達(dá)［14］。而本實(shí)驗(yàn)采用將p53和pRb shRNA和hTERTcDNA建立在一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上，只需轉(zhuǎn)染一個(gè)質(zhì)粒就可以達(dá)到同時(shí)敲除p53和pRb及過表達(dá)hTERT的多重作用，并且提高了細(xì)胞永生化的效果。

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Immortalization of human fallopian tube epithelial cells

GAO Wen1,2, ZANG Rong-yu1, WANG Yan2, YANG Li-na2, LIU Yang1, QI Zi-hao2, YIN Sheng1, YANG Gong2(1.Departements of Gynecological Oncology, Fudan University Shanghai Cancer Center, Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China; 2.Cancer Research Laboratory, Fudan University Shanghai Cancer Center, Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China)

YANG Gong E-mail: yanggong@fudan.edu.cn

Background and purpose: Recent researches indicate that high grade serous ovarian carcinoma is derived from fallopian tube epithelial malignancy. In this study, we used primary fallopian tube epithelium to establish the immortalized cell lines by silencing of tumor suppression genes and introduction of hTERT, in order to further build malignant cell lines and ovarian cancer animal models. Methods: Primary fallopian tube epithelia were isolated and transfected with a plasmid containing pRb and p53 shRNAs combined with hTERT to establish immortalized cell lines. The resulting cells were validated through examining cell population doublings, p53 and pRb expression, SA-β-gal activity; anchorage-independent growth and in vivo tumorgenesis. Results: We successfully established two immortalized fallopian tube epithelial cell lines: FTE248116/p53i+pRbi+hTERT, FTE312249/p53i+pRbi+hTERT through silencing of p53 and pRb and introduction of hTERT simultaneously. Conclusion: The establishment of immortalized cell lines can be accomplished by introduction of p53 and Rb shRNA and overexpression of hTERT, and these cells may be used to establish the transformed cell lines and ovarian cancer animal models.

Human fallopian tube epithelia cells; p53; pRb; hTERT; Immortalization

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.04.00X

R737.32

：A

：1007-3639(2013)04-0241-07

2013-02-25

2013-03-20）

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No: 81171911)。

楊恭 E-mail:yanggong@fudan.edu.cn