劉曉紅李錚朱筑霞李陽王紅梅朱翠萍王旭東

1.貴陽醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，貴州 貴陽 550004；

2.貴陽醫(yī)學(xué)院校醫(yī)院，貴州 貴陽 550004

氟維司群對乳腺癌細胞遷移及局部黏著斑激酶的影響

劉曉紅1李錚1朱筑霞1李陽1王紅梅1朱翠萍2王旭東1

1.貴陽醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，貴州 貴陽 550004；

2.貴陽醫(yī)學(xué)院校醫(yī)院，貴州 貴陽 550004

背景與目的：雌激素(estrogen，E2)受體(estrogen receptor，ER)拮抗劑氟維司群(fulvestrant或ICI 182780，ICI)是治療絕經(jīng)后婦女乳腺癌的新型藥物，而局部粘著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)與乳腺癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究通過觀察E2和ICI單獨或聯(lián)合作用對ER陽性乳腺癌細胞遷移及FAK表達的影響，探討ICI對腫瘤細胞遷移的作用及其與FAK的關(guān)系。方法：采用ER陽性MCF-7乳腺癌細胞為研究模型，以E2(包括酒精，EtOH)和ICI單獨或聯(lián)合刺激細胞，采用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測蛋白表達及相對分子質(zhì)量變化，傷口愈合實驗檢測細胞遷移變化。結(jié)果：E2(10 nmol/L)和EtOH(0.3%)組均可明顯刺激MCF-7細胞遷移(與DMSO組比較，分別增加51.5%和53.6%，P＜0.01)，但E2＋EtOH組對細胞遷移并無協(xié)同作用(與DMSO組比較，增加45.0%)。以ICI(10 μmol/L)預(yù)處理細胞后再給予E2處理，與對照組比較，細胞遷移增加了(38.9±4.9)%(P＜0.01)，與E2組比較減少了(8.32±3.21)%(P＜0.05)；ICI單獨作用可明顯促進細胞遷移(與DMSO組比較，增加19.1%，P＜0.01)。對照組細胞FAK主要為125×103和110×103兩種形式，E2刺激可誘導(dǎo)FAK(125×103)呈現(xiàn)時間依賴性蛋白剪切，生成相對分子質(zhì)量為35×103～70×103的小分子片段，而ICI預(yù)處理可有效阻斷E2誘導(dǎo)的p125FAK蛋白剪切反應(yīng)。結(jié)論：ICI單獨作用可明顯刺激MCF-7乳腺癌細胞遷移，但ICI對E2誘導(dǎo)的MCF-7細胞遷移具有抑制作用，該抑制效應(yīng)可能與ICI阻斷FAK蛋白剪切有關(guān)。

氟維司群；細胞遷移；局部黏著斑激酶；雌激素；乳腺癌

［Key words］Fulvestrant; Cell migration; Focal adhesion kinase; Estrogen; Breast cancer

氟維司群(fulvestrant或ICI 182780，ICI)是一種新型雌激素受體(estrogen receptor，ER)拮抗劑，主要用于治療絕經(jīng)后婦女ER陽性轉(zhuǎn)移性乳腺癌［1］，但ICI的療效有限且會出現(xiàn)治療失?。?-2］。局部黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)在乳腺癌組織表達上調(diào)并與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［3］。細胞遷移(migration)是腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的必要步驟，但關(guān)于ICI對乳腺癌細胞遷移的影響及其機制，目前尚未完全明了［4-5］。本研究以ER陽性乳腺癌細胞MCF-7為模型，采用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)及傷口愈合實驗等方法，探討ICI對乳腺癌細胞遷移的影響及其與FAK的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系及試劑

人乳腺癌細胞系MCF-7購自中國科學(xué)院昆明細胞庫。DMEM(含酚紅或無酚紅)、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、胰蛋白酶及青霉素/鏈霉素購自HyClone公司?；钚蕴继幚硖ヅＱ?charcoal-stripped FBS，CS-FBS)購自BioWest公司。

1.1.2 抗體及重要試劑

17β-雌二醇(17β-estradiol，E2)、ICI182780購自Calbiochem公司、無水乙醇(ethanol，EtOH)購自Sigma公司，抗FAK單克隆抗體購自Millipore公司，抗GAPDH抗體購自Cell Signaling公司，羊抗小鼠IgG-HRP抗體購自博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

MCF-7細胞常規(guī)培養(yǎng)采用DMEM培養(yǎng)基(含10% FBS、1%青霉素及1%鏈霉素)，在37 ℃、潮濕環(huán)境及CO2體積分數(shù)為5%的條件下進行，待細胞滿度達90%時進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細胞劃痕實驗

取對數(shù)生長期細胞制成細胞混懸液并計數(shù)，調(diào)整細胞密度為2×105～3×105個/mL，按每孔1 mL接種于12孔培養(yǎng)板中。加入含10%血清的DMEM培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱使其貼壁，培養(yǎng)2 d后細胞覆蓋率達90%，換成含2%CS-FBS的無酚紅DMEM，24 h后形成單層細胞，用200 μL槍頭作“十”字劃痕，用無菌PBS洗滌3次，換含2%CS-FBS的無酚紅DMEM，隨機分為6組，分別加入0.1% DMSO、10 nmol/L E2、0.3% EtOH、E2+EtOH、10 μmol/L ICI、E2+ ICI處理，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，在倒置顯微鏡下拍照。用Photoshop軟件測量劃痕距離，每孔隨機取3個位點，測算細胞劃痕部位“傷口”寬度，實驗重復(fù)6次。24 h細胞遷移率=(DMSO組傷口寬度-處理組傷口寬度)/處理組傷口寬度×100%。

1.2.3 Western blot檢測

細胞培養(yǎng)至50%～60%覆蓋率后，換以無血清、無酚紅DMEM繼續(xù)培養(yǎng)24 h，以耗盡細胞內(nèi)生性激素。將細胞分為4組：對照組(0.1% DMSO)、E2組(10 nmol/L E2)、ICI組(10 μmol/L)、E2 + ICI組(10 nmol/L E2 +10 μmol/L ICI)。分別于E2組處理0、1、6、12和24 h后，ICI組、E2+ ICI組處理24 h后，加入RIPA裂解液(碧云天公司)裂解細胞。取樣品上清液留用，采用BCA法進行蛋白定量。每個泳道按30 μg蛋白質(zhì)樣品進行上樣，SDS-PAGE電泳分離蛋白，然后將分離蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF (Millipore公司)；5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，按要求加入相應(yīng)抗體室溫雜交1～2 h，4 ℃溫育過夜；然后以TBST洗膜后加入相應(yīng)辣根過氧化物酶標記二抗(1∶2 000)室溫雜交1 h，PVDF膜以化學(xué)發(fā)光試劑盒(Millipore公司)進行顯色。采用自動凝膠成像系統(tǒng)(Syngene公司)進行成像，GeneSnap軟件分析蛋白印跡結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理和分析。數(shù)據(jù)以表示，細胞劃痕實驗結(jié)果分析用單因素方差分析(ANOVA)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 E2和具有E2活性的EtOH對MCF-7細胞遷移的影響

以E2(10 nmol/L)、EtOH(0.3%)分別處理MCF-7細胞，發(fā)現(xiàn)兩組均可顯著刺激細胞遷移，與對照組比較，遷移率分別增加(51.5±4.5)%和(53.6±5.1)%(P＜0.01)，但E2＋EtOH組細胞遷移率增加(45.0±3.6)%，無協(xié)同效應(yīng)(圖1)。

2.2 ICI單獨或與E2聯(lián)合使用對MCF-7細胞遷移的影響

以ICI(10 μmol/L)預(yù)處理MCF-7細胞，發(fā)現(xiàn)ICI對E2(10 nmol/L)誘導(dǎo)的細胞遷移有明顯的抑制作用，與對照組比較增加了(38.9±4.9)%(P＜0.01，圖2)，與E2組比較減少了(8.32±3.21)%(P＜0.05，圖2)。但ICI單獨處理細胞，可見ICI能刺激細胞遷移，與DMSO組比較，遷移率增加了(19.1±3.1)%(P＜0.01，圖2)。

圖 1 傷口愈合實驗結(jié)果顯示E2和EtOH對MCF-7細胞遷移的影響Fig. 1 Wound healing analysis of the effects of E2 and EtOH on migration of MCF-7 cells

圖 2 傷口愈合實驗結(jié)果顯示E2和ICI單獨或聯(lián)合作用對MCF-7細胞遷移的影響Fig. 2 Wound healing analysis of the effects of E2 and ICI on the migration of MCF-7 cells

2.3 E2誘導(dǎo)FAK蛋白表達和剪切及ICI的影響

以E2(10 nmol/L)刺激MCF-7細胞，可見FAK蛋白表達呈時間依賴性(0～24 h)增加，且發(fā)生蛋白剪切，生成相對分子質(zhì)量在35×103～70×103之間的小片段(圖3A)；ICI(10 μmol/L)可阻斷E2誘導(dǎo)的FAK蛋白剪切35×103～70×103片段，但ICI單獨處理對FAK蛋白無明顯影響(圖3B)。

圖 3 Western blot結(jié)果顯示E2誘導(dǎo) FAK表達變化(A)及ICI的抑制效應(yīng)(B)Fig. 3 Western blot analysis of the effect of E2 on FAK expression and its inhibition by ICI

3 討 論

雌激素活性與乳腺癌關(guān)系密切，研究顯示，E2和具有雌激素樣活性的EtOH均可促進乳腺癌惡性演進［6-9］，如E2可通過促進乳腺癌細胞增殖、遷移和浸潤［6-7］。本研究通過離體實驗發(fā)現(xiàn)，E2和EtOH均可明顯刺激MCF-7細胞遷移，但未見協(xié)同效應(yīng)，結(jié)果支持酒精與乳腺癌有關(guān)的文獻報道［8］，提示雌激素活性與乳腺癌發(fā)展存在相關(guān)性。內(nèi)分泌療法是治療乳腺癌的重要措施之一，具有不會引起化療常見的不良反應(yīng)的優(yōu)點。目前主要采用芳香化酶抑制劑以降低體內(nèi)E2水平或拮抗ER以減弱或阻斷E2信號通路，從而達到延緩腫瘤發(fā)展、提高患者存活率和生活質(zhì)量的目的。ICI可用于治療絕經(jīng)后婦女的他莫昔芬耐受性乳腺癌，其療效不亞于芳香酶抑制劑。

一般認為，抗雌激素制劑他莫昔芬對子宮內(nèi)膜細胞具有刺激作用，而作為純ER拮抗劑的ICI無雌激素樣作用。實際上，ICI對乳腺細胞是否具有刺激作用(如促進細胞遷移)目前還存在爭議［4-5］。本研究顯示，ICI對E2誘導(dǎo)的MCF-7細胞遷移具有一定的抑制作用，然而ICI單獨使用可明顯促進細胞遷移。同時發(fā)現(xiàn)，E2誘導(dǎo)的細胞遷移伴隨FAK上調(diào)和蛋白剪切，而ICI可抑制E2誘導(dǎo)細胞遷移及伴隨的FAK蛋白剪切，這可能是ICI阻斷ER的結(jié)果，而ICI單獨作用促進MCF-7細胞遷移的機制可能與興奮G蛋白偶聯(lián)受體30(G protein-coupled receptor 30，GPR 30)有關(guān)［4］。結(jié)果提示，當ER信號通路被阻斷后，乳腺癌細胞還可通過非ER(如GPR30)通路保持對E2刺激的反應(yīng)性(如細胞遷移)。

FAK是一種胞內(nèi)酪氨酸激酶，在腫瘤向惡性侵襲表型演進的過程中起著重要的作用。FAK的蛋白剪切可改變其激酶活性，影響細胞局部黏著動力學(xué)過程及細胞遷移［10］。研究顯示，F(xiàn)AK激酶活性受到其氨基端(N-terminus)結(jié)構(gòu)域的自身抑制作用［10-11］，使野生型FAK酶活性受到天然抑制。本研究組新近資料顯示，E2誘導(dǎo)的FAK蛋白剪切與細胞內(nèi)鈣激活中性蛋白酶(calcium-activated neutral protease，CANP)活化有關(guān)［6］，而CANP對FAK的蛋白剪切點位于FAK的N端［12］，因此有利于FAK的激活。本研究發(fā)現(xiàn)，ICI可顯著抑制E2誘導(dǎo)MCF-7細胞FAK蛋白剪切及細胞遷移，提示FAK變化可能與E2刺激細胞遷移有關(guān)［13］。然而，以ICI單獨刺激也可促進MCF-7細胞遷移，但不影響FAK，可見E2及ICI促進細胞遷移的機制可能有所不同。本研究結(jié)果還提示，在乳腺癌內(nèi)分泌治療方面，應(yīng)考慮同時阻斷ER和非ER信號通路的聯(lián)合治療方案以獲得理想療效。

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《抗癌》雜志征稿啟事

《抗癌》雜志于1988年創(chuàng)刊，主管單位為上海市科學(xué)技術(shù)協(xié)會，主辦單位為上海市抗癌協(xié)會，雜志刊號：CN31-1664/R ISSN 1008-3065。征稿欄目及內(nèi)容如下。

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二、《正誼明道、大醫(yī)精誠》欄目

真實記錄醫(yī)生對患者的關(guān)懷；或是愛崗敬業(yè)、精益求精富有專業(yè)精神的事跡，能讓更多醫(yī)道同仁敬重和學(xué)習(xí)?？梢灾v述患者眼里的醫(yī)生，也可以記錄你的同事。

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Effects of fulvestrant on the migration and focal adhesion kinase in breast cancer cells

LIU Xiaohong1, LI Zheng1, ZHU Zhu-xia1, LI Yang1, WANG Hong-mei1, ZHU Cui-ping2, WANG Xu-dong1(1. Department of Physiology, Guiyang Medical University, Guiyang Guizhou 550004, China; 2. Campus Hospital, Guiyang Medical University, Guiyang Guizhou 550004, China)

WANG Xu-dong E-mail: xdwang@gmc.edu.cn

Background and purpose：Fulvestrant (ICI182780, ICI) is a novel anti-estrogen drug for treatment of metastatic breast cancer, and focal adhesion kinase (FAK) is strongly involved in metastasis of breast cancer. This study was performed to investigate the impact of ICI on the estrogen (E2)-induced cell migration and its association with expression of FAK in estrogen receptor (ER)-positive breast cancer cells. Methods：ER-positive MCF-7 breast cancer cells were employed as a model system. E2, ethanol (EtOH) or ICI was used alone or in combination to treat model cells. Western blot was applied to analyze protein expression and wound healing assay to assess cell migration. Results：Both E2 and EtOH stimulated significant migration of MCF-7 cells, but no cooperative effect was observed. Importantly, ICI had significant inhibitory effect on E2-induced migration, while ICI, when used alone, also enhanced cell migration. When cells were not insulted, FAK was primarily expressed in the forms of 125×103and 110×103, and E2 treatment triggered cleavage of FAK (p125) into low molecular isoforms. E2 treatment produced time-dependent proteolysis of FAK and this effect was blocked by pretreatment with ICI. Conclusion：ICI stimulates cell migration in MCF-7 cells when used alone, while it inhibits E2-enhanced migration possibly by blocking proteolysis of FAK.

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.03.004

R737.9

：A

：1007-3639(2013)03-0179-05

2012-10-25

2012-12-20）

國家自然科學(xué)基金(No：30860093)；貴州省優(yōu)秀人才省長專項基金[No：黔省專合字(2008)56號]。

王旭東 E-mail:xdwang@gmc.edu.cn