復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院大腸外科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

MicroRNA在晚期大腸癌一線化療療效中的預(yù)測(cè)作用

胡勁松 蔡三軍

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院大腸外科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

背景與目的：大腸癌是一種高發(fā)病率的惡性腫瘤，化療可以減少腫瘤的生長(zhǎng)和復(fù)發(fā)。當(dāng)前較為重要的是探究標(biāo)志物能夠預(yù)測(cè)化療耐藥標(biāo)志物，從而幫助確定治療方案。方法：選取2007年11月—2010年5月復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院大腸外科Ⅳ期大腸癌患者手術(shù)標(biāo)本，術(shù)后患者都使用大腸癌術(shù)后規(guī)范化一線化療(希羅達(dá)+奧沙利鉑)。選取化療耐藥與有效癌組織標(biāo)本各3例共6例使用microRNA芯片檢測(cè)。篩選出有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的miRNA：miR-4299、miR-196b、miR-324-5p、miR-455-3p和miR-939，將候選miRNA在100例Ⅳ期大腸癌患者手術(shù)癌組織標(biāo)本中進(jìn)行real-time PCR驗(yàn)證。結(jié)果：通過(guò)芯片篩選，共5個(gè)miRNA可能與大腸癌一線化療耐藥有關(guān)。miR-4299和miR-196b對(duì)化療耐藥有顯著診斷意義。miR-4299的AUC為0.784，而miR-196b的AUC為0.647。兩個(gè)聯(lián)合診斷AUC為0.848，敏感度和特異度分別為67.9%和90.9%。結(jié)論：miR-4299和miR-196b有可能作為診斷對(duì)大腸癌一線化療耐藥的標(biāo)志物。

大腸癌；化療；標(biāo)志物；miR-4299；miR-196b

MicroRNAs(miRNAs)是一類廣泛存在于多種生物體內(nèi)的長(zhǎng)度約18～25個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA，具有調(diào)節(jié)基因表達(dá)的功能。它和mRNA存在互補(bǔ)序列，通常導(dǎo)致翻譯的抑制和基因的沉默。異常的miRNAs表達(dá)和很多疾病密切相關(guān)，miRNA的失調(diào)也和很多類型腫瘤有密切關(guān)系［1-2］。miRNA參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種重要細(xì)胞活動(dòng)的調(diào)控。miRNA基因以多種形式存在于基因組中，近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)miRNA能控制蛋白的表達(dá)，miRNA修飾表達(dá)能影響藥物治療效果［3］。大腸癌是我國(guó)最常見(jiàn)的消化系惡性腫瘤之一，化療是進(jìn)展期大腸癌治療的重要臨床措施［4］。以手術(shù)為主的多學(xué)科綜合治療已經(jīng)得到廣泛的認(rèn)同，全身化療越來(lái)越受到重視，其目的是消滅患者體內(nèi)的微轉(zhuǎn)移灶，增加治愈機(jī)會(huì)，以延長(zhǎng)患者生命，改善生活質(zhì)量。本課題通過(guò)對(duì)Ⅳ期大腸癌組織標(biāo)本miRNA表達(dá)譜的研究，獲得對(duì)一線化療希羅達(dá)+奧沙利鉑(XELOX)耐藥診斷的miRNA，探討其與臨床病理特征的關(guān)系，為大腸癌患者制定個(gè)體化化療方案提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

選取2007年11月—2010年5月在復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院大腸外科行原發(fā)病灶切除術(shù)的Ⅳ期大腸癌患者的手術(shù)標(biāo)本100例，術(shù)后進(jìn)行了規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)的一線XELOX方案化療。本課題分為兩部分，第一部分在100例患者中配對(duì)選擇對(duì)化療耐藥和有效標(biāo)本各3例，共6例。第二部分為驗(yàn)證部分，共100例患者癌組織標(biāo)本，分為耐藥組和有效組。

1.2 試劑

總RNA提取使用mirvana miRNA Isolation kit (Ambion，USA)，miRNA表達(dá)譜使用Agilent human miRNA v162.0 (Agilent technologies，Santa Clara，CA，US)。miRNA擴(kuò)增和逆轉(zhuǎn)錄使用cDNA Synthesis Kit(EXIQON，Denmark)，Master Mix(EXIQON，Denmark)。

1.3 方法

1.3.1 化療后評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)及分組治療反應(yīng)依據(jù)RECIST(version1.0)

每9周進(jìn)行臨床和CT檢查，按照化療后評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)分為部分緩解(partial response，PR)和完全緩解(cmplete response，CR)，并歸為有效組(n=43)；穩(wěn)定(stable disease，SD)和進(jìn)展(progressive disease，PD)歸為耐藥組(n=57)，所有CT檢查都由同一檢查者評(píng)估。

1.3.2 大腸癌miRNA基因芯片表達(dá)檢測(cè)及RTPCR

所有組織標(biāo)本為我院標(biāo)本庫(kù)-80 ℃冰箱保存，研究者對(duì)實(shí)驗(yàn)標(biāo)本采用雙盲?？俁NA提取使用miRNA Isolation kit。結(jié)果測(cè)定使用NanoDrop ND-1000分光光度計(jì)。miRNA表達(dá)譜使用Agilent human miRNA v162.0［5］。芯片共有探針1 367個(gè)，表達(dá)對(duì)照為各研究組織標(biāo)本中的U6含量。根據(jù)miRNA芯片結(jié)果共選擇5個(gè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的miRNA進(jìn)行大樣本驗(yàn)證，使用RT-PCR［6］，首先使用miRNA Isolation kit在組織標(biāo)本中提取總RNA，測(cè)定各組總RNA的濃度，然后轉(zhuǎn)錄與擴(kuò)增使用cDNA synthesis kit和Mix，共40個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系(共10 μL)：Master Mix 5 μL，Primer Forward (1 μmol)1 μL，Primer Reverse(1 μmol)1 μL，DNA 1 μL，MiliQ 2 μL。兩步法擴(kuò)增條件：95 ℃ 10 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。所有數(shù)據(jù)以各研究組織標(biāo)本中的U6為內(nèi)參照。PCR產(chǎn)物取10 μL進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)擴(kuò)增條帶大小。所有RT-PCR重復(fù)3次，取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0 分析軟件(SPSS，Inc，Chicago，IL)處理。對(duì)不同組間比較使用Mann-Whitney U檢驗(yàn)或者Kruskall-Wallis檢驗(yàn)。ROC曲線評(píng)判診斷價(jià)值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床資料

耐藥組57例患者以結(jié)腸癌為多，中分化腺癌和低分化腺癌為主；腫瘤組織全部侵入漿膜或漿膜外；1～3枚淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例，3枚以上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例。TNM分期：全部為Ⅳ期，其中肝轉(zhuǎn)移48例，肺轉(zhuǎn)移7例。有效組43例患者以直腸癌為多，中分化腺癌為主；腫瘤組織全部侵入漿膜或漿膜外；1～3枚淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例，3枚以上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14例。TNM分期：全部為Ⅳ期，其中肝轉(zhuǎn)移29例，肺轉(zhuǎn)移15例。兩組患者在性別、年齡、標(biāo)本部位方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但在肺轉(zhuǎn)移方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.007，表1)。

表 1 大腸癌患者臨床資料Tab. 1 Clinicopathological factors of colorectal cancer patients

2.2 大腸癌miRNA基因芯片表達(dá)

選取化療耐藥(耐藥組n=3)和化療有效(有效組n=3)共6例使用miRNA基因芯片檢測(cè)(圖1)。miRNA基因芯片共有探針1 367個(gè)，其中人miRNA探針共1 200個(gè)，共發(fā)現(xiàn)5個(gè)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的miRNA。分別為miR-4299、miR-196b、miR-324-5p、miR-939、miR-455-3p，其中miR-196b、miR-324-5p、miR-455-3p在耐藥組中低表達(dá)，miR-4299、miR-939在耐藥組中高表達(dá)(表2)。

2.3 miR-4299、miR-196b、miR-324-5p、miR-939和miR-455-3p在大腸癌中的表達(dá)

通過(guò)RT-PCR驗(yàn)證研究miRNA在大腸癌中的表達(dá)，研究分兩組，耐藥組和有效藥組共100例。miR-4299耐藥組為5.51±4.78，有效組為1.90±2.41。miR-196b耐藥組為10.67±7.72，有效組為20.74±26.47。miR-324-5p耐藥組為0.33±1.18，有效組為0.58±0.88。miR-455-3p耐藥組為1.29±3.49，有效組為3.00±4.93。miR-939耐藥組為2.65±13.04，有效組為0.10±0.39。兩組miR-4299和miR-196b的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，miR-324-5p、miR-939和miR-455-3p的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖2)。

圖 1 大腸癌miRNA基因芯片圖Fig. 1 Dysregulation of miRNA in human mCRC by the miRNA profiling analysis

圖 2 差異性miR-4299、miR-196b、miR-324-5p、miR-455-3p和miR-939在有效組合耐藥組中的散點(diǎn)圖Fig. 2 Dots indicate of the relative quantification (RQ) values of miR-4299, miR-196b, miR-324-5p, miR-455-3p and miR-939 expression levels, normalized by U6

表 2 對(duì)一線化療(希羅達(dá)+奧沙利鉑)耐藥組和敏感組比較差異miRNA表達(dá)Tab. 2 Significant dysregulation of miRNAs in chemoresistant CRCs

2.4 miR-4299和miR-196b對(duì)耐藥大腸癌診斷的價(jià)值

ROC曲線分析表明，miR-4299的AUC為 0.784(95% CI：0.670 ～0.897)，miR-196b的AUC為0.647(95%CI：0.508～0.786)，表明miR-4299對(duì)耐藥大腸癌有較好的診斷價(jià)值。根據(jù)ROC曲線獲得miR-4299的截?cái)嘀禐?.459，敏感度為71.4%，特異度為88.6%(圖3A)。miR-196b的截?cái)嘀禐?.454，敏感度為64.3%，特異度為65.9%(圖3B)。miR-4299聯(lián)合miR-196b的AUC為0.848 (95% CI：0.756～0.941)，敏感度為67.9%，特異度為90.9%(圖3C)，能進(jìn)一步提高對(duì)耐藥大腸癌的診斷價(jià)值。

圖 3 miR-4299 、miR-196b 、miR-4299 +miR-196b的 ROC曲線分析圖Fig. 3 Receiver operating characteristics (ROC) curve analysis using miR-4299 and miR-196b for discriminating colorectal tumors of chemoresistance

3 討 論

大腸癌為常見(jiàn)的消化系統(tǒng)腫瘤之一，治療主要以手術(shù)為主的綜合性治療。而手術(shù)患者中約50%在術(shù)后5年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。術(shù)前新輔助化療可降低大腸癌分期、改善術(shù)式選擇、提高近期療效；術(shù)后化療可抑制大腸癌復(fù)發(fā)、治療腫瘤轉(zhuǎn)移。Tournigand等［7］的一項(xiàng)Ⅲ期隨機(jī)研究顯示，化療使轉(zhuǎn)移性大腸癌患者的總生存期延長(zhǎng)20.6～21.5個(gè)月。因此，化療的成敗將直接關(guān)系大腸癌患者的預(yù)后［8］。其療效取決于腫瘤對(duì)化療藥物的敏感程度，這由腫瘤自身的生物學(xué)特性決定。究其原因可能是由于腫瘤的多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)。MDR指腫瘤細(xì)胞被一種藥物誘發(fā)耐藥后，同時(shí)對(duì)其他多種結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制完全不同的藥物產(chǎn)生交叉耐藥的一種現(xiàn)象［9］。MDR是一個(gè)多基因參與、涉及多種基因產(chǎn)物的復(fù)雜過(guò)程。滿意的化療是指在獲得有效的治療效果的同時(shí)，藥物毒性更小。若能盡早預(yù)測(cè)大腸癌患者對(duì)化療藥物的耐藥，可增加醫(yī)療效費(fèi)比，縮短患者化療時(shí)間，減少不良反應(yīng)。

近年研究表明，miRNA在多種惡性腫瘤中表達(dá)對(duì)腫瘤具有診斷價(jià)值并參與腫瘤的進(jìn)展［10-11］。本研究通過(guò)1 200個(gè)探針對(duì)大腸癌組織標(biāo)本進(jìn)行篩選，篩選同時(shí)對(duì)組織標(biāo)本進(jìn)行配對(duì)研究，以減少干擾因素。結(jié)果顯示，miR-4299、miR-196b、miR-324-5p、miR-939、miR-455-3p可能與大腸癌一線化療耐藥有關(guān)。通過(guò)對(duì)miR-4299和miR-196b進(jìn)行ROC曲線的分析，miR-4299和miR-196b對(duì)化療耐藥有明顯診斷意義。miR-4299的AUC為0.784，而miR-196b的AUC為0.647。兩個(gè)聯(lián)合的AUC升高為0.848，敏感度和特異度分別為67.9%和90.9%，較單個(gè)miR敏感性和特異性有所提高，更有應(yīng)用價(jià)值。Svoboda等［12］曾對(duì)20例新輔助放化療術(shù)后患者組織標(biāo)本進(jìn)行研究，通過(guò)microRNA芯片檢測(cè)，認(rèn)為miR-196b有可能作為預(yù)測(cè)放化療標(biāo)志物，但該文獻(xiàn)沒(méi)有表明能否單獨(dú)對(duì)耐藥患者進(jìn)行預(yù)測(cè)，且研究標(biāo)本較少。Popovic等［13］報(bào)道m(xù)iR-196b過(guò)表達(dá)對(duì)正常骨髓造血細(xì)胞增殖和生存有顯著影響。Tsaithe等［14］報(bào)道m(xù)iR-196b在胃癌組織中頻繁表達(dá)為低甲基化，有可能作為腫瘤標(biāo)志物存在。

總之，miR-4299和miR-196b有可能作為診斷對(duì)大腸癌一線化療耐藥的標(biāo)志物，尤其對(duì)術(shù)后化療有一定的指導(dǎo)意義。但需要更多大樣本的其他腫瘤數(shù)據(jù)加以證實(shí)和深入研究。

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The microRNA of advanced colorectal cancer predict efficacy of first-line chemotherapy

HU Jin-song, CAI San-jun (Department of Colorectal Cancer, Fudan University Shanghai Cancer Center, Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China)

CAI San-jun E-mail: caisanjun@gmail.com

Background and purpose: Colorectal cancer (CRC) is the most frequently occurring primary malignant tumor. Chemotherapy can reduce the risk of local and distant relapse. Therefore, it is very important to find new biomarkers that can predict chemoresistant and help in treatment decisions. Methods: In this study, we examined the expression levels of 1 200 human miRNAs in 6 CRC tissues, using miRNA profiling assay arrays. A validation study was done to corroborate a subset of the results, including expression levels of miR-4299, miR-196b, miR-324-5p, miR-455-3p and miR-939, by analyzing 100 specimens of stage Ⅳ colorectal adenocarcinoma (not respond and respond to the chemotherapy) to quantitative real-time PCR. We modeled the relationship between the expression levels of these miRNAs and the survival rate of 100 CRC patients by Kaplan-Meier method. Results: Expression profiles in CRCs suggested that 5 miRNAs were candidate markers associated with the chemoresistance of colorectal cancer. We found that miR-4299 and -196b had significant diagnostic value for chemoresistance CRC. miR-4299 yielded an AUC (the areas under the ROC curve) of 0.784 and miR-196b yielded an AUC of 0.647 in discriminating CRC from controls. Combined ROC analysis using these 2 miRNAs revealed an elevated AUC of 0.848 with 67.9% sensitivity and 90.9% specificity in discriminating chemoresistance CRC. The low level of miR-4299 expression and the high level of -196b expression are significantly correlated with the good survival of CRC patients. Conclusion: These data suggest that miR-4299 and -196b have strong potential as novel biomarkers for chemoresistant detection of colorectal cancer.

Colorectal cancer; Chemotherapy; Biomarkers; miR-4299; miR-196b

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.07.004

R735.3

：A

：1007-3639(2013)07-0499-06

2013-01-23

2013-05-25）

國(guó)家985Ⅲ期基金資助項(xiàng)目(No：YFX0102)。

蔡三軍 E-mail:caisanjun@gmail.com