河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院外三科，河北 石家莊 050011

人胃癌耐藥細胞株中鋅指蛋白139和多藥耐藥基因表達的關(guān)系及意義

李勇 趙群 檀碧波 范立僑 劉慶偉 焦志凱 趙雪峰 郝英杰

河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院外三科，河北 石家莊 050011

背景與目的：研究發(fā)現(xiàn)鋅指蛋白139(ZNF139)在胃癌中表達異常，但ZNF139與胃癌的多藥耐藥性(multidrugresistance，MDR)關(guān)系尚不明確。本研究檢測了人胃癌細胞株SGC7901和耐藥細胞株SGC7901/ADR中ZNF139和MRP-1、MDR1/P-gp、GST-π的mRNA和蛋白表達情況，并對其表達關(guān)系和意義進行分析。方法：體外培養(yǎng)SGC7901、SGC7901/ADR，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶連反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測兩種細胞ZNF139和MRP-1、MDR1/P-gp、GST-π mRNA表達情況，采用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)法檢測各基因蛋白表達變化情況。合成針對ZNF139的小干擾RNA(siRNA-ZNF139)重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染SGC7901/ADR，檢測轉(zhuǎn)染前后SGC7901/ADR中MRP-1、MDR1/P-gp、GST-π表達的變化。結(jié)果：SGC7901和SGC7901/ADR兩種細胞中均有ZNF139、MRP-1、MDR1/P-gp、GST-π mRNA和蛋白陽性表達，SGC7901/ADR細胞中ZNF139、MRP-1、MDR1/ P-gp、GST-π mRNA和蛋白表達均明顯高于SGC7901細胞(P＜0.05)。轉(zhuǎn)染siRNA-ZNF139后SGC7901/ADR細胞中ZNF139表達明顯受到抑制，MRP-1、MDR1/P-gp、GST-π表達也明顯降低(P＜0.05)。結(jié)論：ZNF139通過上調(diào)MRP-1、MDR1/P-gp、GST-π基因表達而參與胃癌多藥耐藥形成。

鋅指蛋白139；胃癌；多藥耐藥性

化療在胃癌的綜合治療中占有重要地位，然而腫瘤多藥耐藥性(multidrugresistance，MDR)嚴重影響化療的效果。迄今關(guān)于胃癌MDR的機制研究尚未取得突破，已發(fā)現(xiàn)多種基因及調(diào)控機制在其中發(fā)揮作用［1-3］。最近研究表明，轉(zhuǎn)錄因子鋅指蛋白(ZNF)家族在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及MDR中發(fā)揮了重要作用［4-5］。我們前期蛋白質(zhì)組學(xué)研究鑒定出的與胃癌關(guān)系密切的ZNF139即為鋅指蛋白超家族成員［6］，而關(guān)于ZNF139是否與胃癌MDR有關(guān)鮮見報道。MRP-1、MDR1/P-gp、GST-π是目前認為導(dǎo)致胃癌MDR作用比較確切的基因。故本研究檢測了耐藥性不同的胃癌細胞株ZNF139、MRP-1、MDR1/P-gp、GST-π的表達，并合成了針對ZNF139的小干擾RNA重組質(zhì)粒siRNA-ZNF139，以該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染高表達ZNF139的胃癌細胞株，進一步檢測了轉(zhuǎn)染前后多藥耐藥基因的表達變化，為探討ZNF139參與胃癌MDR的調(diào)節(jié)機制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

人胃癌細胞株SGC7901購自中國科學(xué)院上海細胞研究所，胃癌耐多柔比星(ADR)細胞SGC7901/ADR由第四軍醫(yī)大學(xué)消化病研究所樊代明院士惠贈，本研究室保種。RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司，胎牛血清購自杭州四季青公司，TRIzol購自美國Invitogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Promega公司，PCR引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計合成，全蛋白提取試劑盒購自南京凱基生物公司，蛋白定量BCA試劑盒購自上海捷瑞生物工程公司，兔抗人ZNF139單克隆抗體購自美國Sigma公司，兔鼠抗人多克隆抗體MRP-1、P-gp、GST-π購自美國Santa Cruz公司，siRNAZNF139質(zhì)粒由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，質(zhì)粒中提試劑盒EndoFree Plasmid Maxi Kit購自北京天根公司，X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent購自美國Sigma公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

SGC7901用10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，SGC7901/ADR細胞在含有0.4 mg/L ADR中培養(yǎng)以維持其耐藥表型。取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.3 靶向siRNA-ZNF139干擾質(zhì)粒的構(gòu)建

由上海吉瑪技術(shù)有限公司合成針對ZNF139的siRNA。siRNA-ZNF139模板序列為：5’-GATCCACCTCGGAAGATTCAGCATTTCA AGAGAATGCTGAATCTTCCGAGGTTTA-3’(正義鏈)，5’-AGCTTAAACCTCGGAAGAT TCAGCATTCTCTTGAAATGCTGAATCTTC CGAGGTG-3’(反義鏈)；同時設(shè)計合成siRNAZNF139無效對照序列：5’-GATCCGACGAGTT GACTGCGATTGTTCAAGAGACAATCG CAGTCAACTCGTCAGA-3’(正義鏈)，5’-AGCT TCTGACGAGTTGACTGCGATTGTCTCTTG AACAATCGCAGTCAACTCGTCG-3’(反義鏈)。各重組質(zhì)粒經(jīng)擴增及純化后用于后續(xù)實驗。

1.4 細胞轉(zhuǎn)染

SGC7901/ADR細胞分為空白對照組(0.9%NaCl溶液組)、陰性對照組(含無效對照序列的質(zhì)粒)和陽性質(zhì)粒組，陰性對照組和陽性質(zhì)粒組轉(zhuǎn)染濃度均為0.8 μg/mL。用X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染細胞融合度為70%～90%的胃癌細胞后37 ℃培養(yǎng)48 h。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶連反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測各基因mRNA表達

取2×107個細胞進行總RNA提取。分別收集SGC7901和SGC 7901/ADR，TRIzol法提取組織RNA，按照試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行RT-PCR檢測ZNF139、MRP-1、MDR1、GST-π各基因mRNA表達。ZNF139基因的上游引物為：5’-GCACAGGAGAAGGATGGTATCG-3’，下游引物5’-TGTTTGAAGTGGGACTGGGTG-3’；MRP1基因的上游引物為：5’-ATACC TGCTGTTCGGATTT-3’，下游引物5’-CGCATAGTGGATGGCTTT-3’；MDR1：5’-TTGTTTGCCACCACGATAG-3’和5’-ACTGCTTCGCTTTCTGTGTC-3’；GST-π：5’-AGTCCAATACCATCCTGCGTC-3’和5’-CACTGTTTCCCGTTGCCATT-3’；GAPDH的上游引物為：5’-AGAAGGCTGG GGCTCATTTG-3’，下游引物5’-AGGGGC CATCCACAGTCTTC-3’。 RT-PCR按試劑盒說明書配制20 μL反應(yīng)體系：上游引物1 μL，下游引物1 μL，PCR藍色體系10 μL，稀釋10倍的cDNA 樣品2 μL，去離子水6 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 10 min預(yù)變性，94 ℃ 30 s，(ZNF139，55 ℃；MDR1、MRP1 57 ℃；GAPDH 58 ℃)退火60 s，72 ℃ 45 s，共30個循環(huán)，72 ℃5 min延伸。擴增產(chǎn)物以GAPDH基因作內(nèi)參照，用凝膠成像系統(tǒng)觀察并照相。使用Syngene凝膠分析系統(tǒng)軟件掃描各條帶灰度值，以各自指數(shù)(灰度值和內(nèi)參照灰度值的比值)進行mRNA表達水平的半定量分析。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測各基因蛋白表達情況

收集2×107個細胞提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度，每個樣品上樣量50 μg。經(jīng)SDSPAGE電泳分離后，切膠、轉(zhuǎn)PVDF膜。20 mL封閉液(含5%脫脂奶粉的 PBST)室溫搖床溫育1.5 h，棄封閉液，加入兔抗人ZNF139單克隆抗體(1∶400一抗稀釋液稀釋)，鼠抗人MRP-1、 P-gp、GST-π單克隆抗體(1∶200一抗稀釋液稀釋)，4 ℃溫育過夜后洗膜，加入羊抗兔/鼠二抗( 1∶3 000二抗稀釋液稀釋)室溫搖床溫育1.5 h。洗膜后然后紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃描，以GAPDH作為內(nèi)參計算各蛋白質(zhì)表達的相對表達強度。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 SGC7901和SGC7901/ADR細胞中ZNF139和MRP-1、MDR1、GST-π mRNA的表達

人胃癌細胞SGC7901和耐藥細胞SGC7901/ ADR中ZNF139、MRP-1、MDR1、GST-π mRNA均有表達，在耐藥細胞SGC7901/ADR中ZNF139、MRP-1、MDR1、GST-π mRNA表達均明顯高于人胃癌細胞SGC7901(P＜0.05，圖1)。

2.2 SGC7901和SGC7901/ADR細胞中ZNF139和MRP1蛋白表達

SGC7901和SGC7901/ADR中ZNF139、MRP-1、P-gp、GST-π蛋白均有表達，但在SGC7901/ADR細胞中ZNF139、MRP-1、P-gp、GST-π蛋白表達均明顯高于在SGC7901細胞中的表達(P＜0.05，圖2)。

圖 1 胃癌細胞株SGC7901和耐藥細胞株SGC7901/ADR中ZNF139、MRP-1、MDR1、GST-π mRNA的表達Fig. 1 Expression of ZNF139, MRP-1, MDR1, GST-π mRNA in gastric cancer cell line SGC7901 and SGC7901/ADR

圖 2 胃癌細胞株SGC7901和耐藥細胞株SGC7901/ADR中ZNF139、MRP-1、MDR1、GST-π蛋白的表達Fig. 2 Expression of ZNF139, MRP-1, MDR1, GST-π protein in gastric cancer cell line SGC7901 and SGC7901/ADR

2.3 siRNA-ZNF139轉(zhuǎn)染SGC7901/ADR細胞后細胞中ZNF139、MRP-1、MDR1、GST-π mRNA表達情況

RT-PCR結(jié)果顯示，與空白對照組和陰性對照組相比，陽性質(zhì)粒組siRNA-ZNF139轉(zhuǎn)染SGC7901/ADR細胞后細胞中ZNF139 mRNA明顯降低，同時多藥耐藥基因MRP-1、MDR1、GST-π mRNA也均明顯降低(P＜0.05，圖3)。

2.4 siRNA-ZNF139轉(zhuǎn)染SGC7901/ADR細胞后細胞中ZNF139、MRP-1、MDR1、GST-π蛋白質(zhì)表達情況

Western blot結(jié)果顯示，與空白對照組和陰性對照組相比，陽性質(zhì)粒組siRNA-ZNF139轉(zhuǎn)染SGC7901/ADR細胞后細胞中ZNF139 蛋白水平明顯降低，同時多藥耐藥基因MRP-1、MDR1、GST-π的蛋白也均明顯降低(P＜0.05，圖4)。

圖 3 siRNA-ZNF139轉(zhuǎn)染胃癌耐藥細胞株SGC7901/ADR后ZNF139、MRP-1、MDR1、GST-π mRNA的表達Fig. 3 Expression of ZNF139, MRP-1, MDR1, GST-π mRNA in gastric cancer cell line SGC7901/ADR after transfected with siRNAZNF139

圖 4 siRNA-ZNF139轉(zhuǎn)染胃癌耐藥細胞株SGC7901/ADR后ZNF139、MRP-1、MDR1、GST-π 蛋白質(zhì)的表達Fig. 4 Expression of ZNF139, MRP-1, MDR1, GST-π proteins in gastric cancer cell line SGC7901/ADR after transfected with siRNAZNF139

3 討 論

化療是治療胃癌的主要手段之一，但腫瘤細胞產(chǎn)生的MDR常導(dǎo)致化療失敗，造成腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)。關(guān)于胃癌MDR的機制，目前發(fā)現(xiàn)有經(jīng)典MDR途徑、凋亡抑制途徑等在其中發(fā)揮作用，許多MDR相關(guān)基因參與其中，但機制還不明確。本課題組前期研究中，應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)ZNF139與胃癌關(guān)系密切［6］。ZNF作為具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的一類蛋白質(zhì)，含有特殊鋅指結(jié)構(gòu)域，與腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲及MDR均有密切的關(guān)系［7-9］。為了解ZNF139與胃癌MDR的關(guān)系，本研究檢測了胃癌細胞株SGC7901和穩(wěn)定的耐多柔比星細胞株SGC7901/ADR中ZNF139和MDR基因MRP-1、MDR1/P-gp、GST-π的表達。本研究所使用的SGC7901/ADR由第四軍醫(yī)大學(xué)樊代明院士實驗室培養(yǎng)建株，與親本細胞相比，具有更強的MDR特性并能夠穩(wěn)定傳代。結(jié)果顯示，耐藥細胞株中ZNF139和MRP-1、MDR1/P-gp、GST-π的mRNA和蛋白質(zhì)表達均高于親本胃癌細胞株，說明SGC7901/ADR的強耐藥性與MRP-1、MDR1/P-gp、GST-π表達增強有關(guān)，在此過程中ZNF139表達也明顯增高，提示ZNF139可能在胃癌MDR表型變化的過程中發(fā)揮了作用。

為進一步分析ZNF139參與胃癌細胞MDR的機制，本研究應(yīng)用RNA干擾技術(shù)合成了針對ZNF139的小干擾RNA重組質(zhì)粒，并將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進入高表達ZNF139的胃癌耐藥細胞株SGC7901/ADR。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒和空白對照的SGC7901/ADR中ZNF139并無明顯變化；而轉(zhuǎn)染陽性siRNA-ZNF139質(zhì)粒的SGC7901/ ADR中ZNF139明顯降低。說明本研究合成的siRNA成功抑制了ZNF139表達，可作為直接結(jié)果對ZNF139的分子調(diào)控機制進行分析。對SGC7901/ADR中多藥耐藥基因的檢測發(fā)現(xiàn)，隨著ZNF139受到抑制，細胞中MRP-1、MDR1/ P-gp、GST-π表達明顯降低。這一結(jié)果從反面提示ZNF139可通過促進MRP-1、MDR1/P-gp、GST-π等多藥耐藥基因的表達參與胃癌細胞耐藥性的形成。但有關(guān)ZNF139調(diào)節(jié)這些基因的具體機制還有待進一步研究。

總之，本研究初步證實ZNF139在胃癌MDR中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，該基因可上調(diào)MRP-1、MDR1/P-gp、GST-π等基因的表達而參與胃癌多藥耐藥。但本研究的內(nèi)容處于初級階段，要了解ZNF139的準確功能，還需要進一步針對ZNF139的分子機制進行研究。

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《中國癌癥雜志》舉辦繼續(xù)教育函授班通知

經(jīng)本刊編委會討論決定，本刊從2013年下半年起舉辦2014年度繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育函授班。具體方法如下：

一、2013年第8期起開設(shè)2014年度函授繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育專欄，本年度的主要內(nèi)容包括：胰腺癌、食管癌、胃癌的病理診斷、放射治療及內(nèi)外科治療等。每期刊登1講，共12講，2014年第8期刊登考試試題，第9期刊登正確答案，要求學(xué)員認真閱讀講座后答題，并將答案寄至編輯部（復(fù)印無效），考卷經(jīng)專人統(tǒng)一審閱，合格者授予Ⅱ類繼續(xù)教育學(xué)分10分，學(xué)分證書由復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院頒發(fā)。

二、參加對象：所有正在從事醫(yī)學(xué)專業(yè)技術(shù)工作的衛(wèi)生技術(shù)人員。預(yù)參加者請寫好本人姓名、年齡、性別、職稱、職務(wù)、學(xué)歷、選派單位名稱（地址及郵政編碼）、所在科室、聯(lián)系電話等寄往本編輯部（E-mail：zgaz@chinajournal.net.cn；zgazzz@163.com），同時通過郵局匯款（單位名稱：《中國癌癥雜志》編輯部；地址：上海市徐匯區(qū)東安路270號）的方式支付函授教育費，并請在匯款備注中注明“2014年度函授繼續(xù)教育”。編輯部收到學(xué)員報名和函授教育費后編號登記注冊，隨即寄出注冊費發(fā)票，并按時寄上每期刊物。即日起開始報名。

三、學(xué)員每人收費200元，贈送12期雜志。編輯部依據(jù)學(xué)員報名登記注冊編號、交費記錄和考試成績于2014年10月30日以前寄發(fā)學(xué)分證書。

四、為保證函授教育質(zhì)量，編委會邀請有關(guān)專家進行出題、閱卷工作，編輯部設(shè)專人負責。咨詢電話：021-64188274；傳真：021-64043766；郵編：200032；聯(lián)系人：王露。歡迎廣大醫(yī)務(wù)人員踴躍參加。

Relationship between ZNF139 and multidrug resistance(MDR) related genes in SGC7901 and SGC7901/ADR cell lines

LI Yong, ZHAO Qun, TAN Bi-bo, FAN Li-qiao, LIU Qing-wei, JIAO Zhi-kai, ZHAO Xue-feng, HAO Ying-jie (Department of Gastrointestinal Surgery, the Fourth Affiliated Hospital, Hebei Medical University, Shijiazhuang Hebei 050011, China)

LI Yong E-mail: li_yong_hbth@126.com

Background and purpose: It was reported that zinc finger protein 139 (ZNF139) was expressed aberrantly in gastric cancer. But the relationship between ZNF139 and multidrug resistance (MDR) of gastric cancer is still not clear. The purpose of this research was to investigate the expressions and significance of ZNF139, MRP-1, MDR1/P-gp, GST-π in human gastric carcinoma cell lines SGC7901 and SGC7901/ADR. Methods: The expressions of ZNF139, MRP-1, MDR1/P-gp, GST-π were determined with RT-PCR and Western blot in SGC7901 and SGC7901/ADR cell lines. Then siRNA recombinant plasmid of targeting ZNF139 gene was constructed and imported into gastric cancer cell line SGC7901/ADR, and the expressions of MRP-1, MDR1/P-gp, GST-π were tested simultaneously. Results: The expressions of ZNF139, MRP-1, MDR1/P-gp, GST-π were higher in SGC7901/ADR than in SGC7901(P＜0.05). ZNF139 was inhibited obviously after siRNA-ZNF139 was transfected into SGC7901/ADR, and expression of MRP-1, MDR1/P-gp, GST-πdecreased(P＜0.05). Conclusion: ZNF139 may be invovled in multidrug resistance (MDR) of gastric cancer by up-regulating MRP-1, MDR1/P-gp and GST-π.

Zinc finger protein 139; Gastric cancer; Multidrug resistance

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.07.003

R735.2

：A

：1007-3639(2013)07-0493-06

2013-01-18

2013-05-28）

國家自然科學(xué)基金(No：81072033)；河北省自然科學(xué)基金(No：C2010000619)；河北省普通高校強勢特色學(xué)科資助項目(No：冀教高［2005］52)；河北省衛(wèi)生廳科研基金資助項目(No：20110460)。

李勇 E-mail:li_yong_hbth@126.com