浙江省腫瘤醫(yī)院，浙江省腫瘤研究所，

浙江省胸部腫瘤(肺、食管)診治技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州310022

MicroRNA-31在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系

羅君 凌志強(qiáng) 彭兵鋒 袁嘉敏 鄭智國 毛偉敏

浙江省腫瘤醫(yī)院，浙江省腫瘤研究所，

浙江省胸部腫瘤(肺、食管)診治技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州310022

背景與目的：研究發(fā)現(xiàn)，許多微小RNA(microRNAs，miRNAs)與惡性腫瘤密切相關(guān)，其中miR-31(microRNA-31)在許多腫瘤中呈異常改變。中國是食管鱗狀上皮細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)最高發(fā)的地區(qū)之一。本研究旨在調(diào)查miR-31在ESCC中的表達(dá)水平與臨床病理學(xué)因素以及預(yù)后的關(guān)系。方法：采用實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RTPCR)技術(shù)檢測(cè)食管癌細(xì)胞株KYSE410、EC1和EC9706，以及81例ESCC組織和癌旁正常組織中miR-31的表達(dá)水平。結(jié)果與臨床資料和隨訪結(jié)果結(jié)合作統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果：在3株ESCC細(xì)胞株以及75.31%的ESCC組織中，miR-31表達(dá)上調(diào)。并且miR-31的高表達(dá)與更嚴(yán)重的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.043)、更深的浸潤(rùn)深度(P=0.002)以及更晚期的病理分期有關(guān)(P=0.027)，而與其他臨床病理學(xué)因素?zé)o關(guān)(P＞0.05)。此外，miR-31的高表達(dá)與較差的無進(jìn)展生存期(progression-free survival，PFS)有關(guān)(Kaplan-Meier分析P=0.014，多變量Cox分析P=0.021)。結(jié)論：miR-31可能是ESCC一項(xiàng)新的診斷和預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo)。

食管鱗狀細(xì)胞癌；miR-31；臨床病理學(xué)；生存期

食管癌是常見的消化道腫瘤，其發(fā)生率排在全世界惡性腫瘤的第七位，病死率居第六位［1］。中國是食管癌高發(fā)區(qū)，每年全球50%的食管癌發(fā)生在中國，而其中約90%是食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)。大部分ESCC直到疾病的晚期癥狀都不明顯，因此此類患者往往診斷晚、預(yù)后差、死亡率高。人們亟需找到能夠在病變?cè)缙诒惶禺愋宰R(shí)別的分子標(biāo)志，以有效地幫助早期診斷和判斷預(yù)后，但目前對(duì)這種“完美”的分子標(biāo)志的探索尚未成功［2］。

微小RNA(micro-RNA，miRNA)是一類長(zhǎng)約21～25個(gè)核苷酸的高度保守的非編碼單鏈小分子RNA，由相應(yīng)的基因編碼，轉(zhuǎn)錄加工形成，通過調(diào)控靶基因的表達(dá)，產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing)。miRNA在細(xì)胞增殖、凋亡、發(fā)展和分化中起重要的調(diào)控作用，并與腫瘤的發(fā)病和進(jìn)展關(guān)系密切。而在業(yè)已發(fā)現(xiàn)的眾多miRNA中，miR-31被認(rèn)為是調(diào)控腫瘤惡性生物學(xué)行為的重要基因之一［3］。本研究應(yīng)用實(shí)時(shí)RT-PCR技術(shù)，分別檢測(cè)ESCC細(xì)胞株及手術(shù)切除標(biāo)本中miR-31的表達(dá)水平，并結(jié)合臨床病理資料及生存分析，探討miR-31在ESCC發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中的潛在作用。

1 材料和方法

1.1 材料

人食管癌細(xì)胞株KYSE410、EC1及EC9706為本所保存，正常食管上皮細(xì)胞采用癌旁正常組織中分離的細(xì)胞原代培養(yǎng)72 h獲得。本實(shí)驗(yàn)采用81例ESCC組織及相應(yīng)癌旁正常組織，均來自于2009年2月—2010年9月浙江省腫瘤醫(yī)院食管癌手術(shù)后組織標(biāo)本，均經(jīng)病理診斷為鱗狀細(xì)胞癌，標(biāo)本的使用得到醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。其中51例標(biāo)本手術(shù)切除后立即取材，癌組織取自手術(shù)切除標(biāo)本中肉眼觀察的腫瘤組織，癌旁正常組織標(biāo)本取自距腫瘤邊緣至少5 cm處的肉眼下無瘤組織。另30例標(biāo)本于手術(shù)切除后快速液氮冷凍儲(chǔ)存，后經(jīng)顯微病理切割手工分類。所有腫瘤及正常組織標(biāo)本收集后儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱中以備RNA提取。腫瘤分級(jí)、TNM分期按照國際抗癌聯(lián)盟(international union against cancer，UICC)2009年第七版食管癌分期標(biāo)準(zhǔn)：其中高、中分化65例，低分化16例；Ⅰ、Ⅱ期34例，Ⅲ、Ⅳ期47例；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移50例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例。81例腫瘤患者中，男性70例，女性11例，年齡40～74歲，平均59.7歲，其中≥60歲41例，＜60歲40例。術(shù)前均未接受化療或放療。電話隨訪截止2011年10月10日，其中失訪5例(6.17%)，失訪者在生存分析中以最后有效隨訪日期作為截尾值處理。

細(xì)胞培養(yǎng)用RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清均購自Gibco公司。RNA提取試劑盒miRNeasy迷你試劑盒(編碼：130171813)購于Qiagen公司，瓊脂糖、0.5% TBE液、EB液、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript?miRNA cDNA 合成試劑盒 (編碼：D350A)和real time RT-PCR試劑盒SYBR?Premix Ex Taq?Ⅱ (編碼：DRR081A)購于TaKaRa公司。引物由上海Invitrogen公司合成。實(shí)時(shí)RT-PCR上游引物序列：mir-31：5’-AGGCAAGATGCTGGCATAGCT-3’，內(nèi)參基因RNU6B(U6 small nuclear RNA)：5’-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3’，下游通用引物由逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript?miRNA cDNA合成試劑盒提供。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

3株食管癌細(xì)胞培養(yǎng)于含15%胎牛血清、青霉素100 mg/L、鏈霉素100 mg/L的RPMI-1640培養(yǎng)液中，細(xì)胞置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2～3 d傳代1次，取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于試驗(yàn)。

1.3 總RNA提取

按照miRNeasy迷你試劑盒的說明書提取腫瘤細(xì)胞及組織中的總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)量，判定所取總RNA的濃度和純度，要求光密度值A(chǔ)260/A280＞1.8。取1 μL RNA溶液與1.5%的變性瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，測(cè)定RNA的完整性。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄

取1 μg總RNA使用PrimeScript?miRNA cDNA合成試劑盒進(jìn)行cDNA的合成，具體操作參照使用說明。

1.5 PCR擴(kuò)增

實(shí)時(shí)RT-PCR的PCR擴(kuò)增及熔解曲線分析均使用ABI 7500PCR儀(Applied Biosystems)，采用20 μL的反應(yīng)體系，每個(gè)樣本重復(fù)3次，求平均Ct值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。具體操作參照SYBR?Premix Ex Taq?Ⅱ的使用說明。反應(yīng)過程具體為：50 ℃激活聚合酶2 min，95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性5 s，60 ℃退火和延伸34 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。結(jié)束后通過95 ℃15 s，60 ℃ 1 min，85 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s制作熔解曲線。RT-PCR結(jié)果按照2-ΔΔCT法［4］進(jìn)行處理：首先獲取每個(gè)樣本中miR-31及內(nèi)參基因RNU6B的Ct值，計(jì)算ΔCT=Ct(miR-31)-Ct(U6)；再根據(jù)ΔΔCT=ΔCT(腫瘤組織/細(xì)胞)-ΔCT(癌旁正常組織/細(xì)胞)，進(jìn)一步計(jì)算mir-31在腫瘤組織與癌旁正常組織之間表達(dá)倍數(shù)的差異：若ΔΔCT＜0，則表達(dá)升高2-ΔΔCT倍；若ΔΔCT≥0，則表達(dá)降低2ΔΔCT倍。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，各組間miR-31表達(dá)倍數(shù)均值的差異采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，生存曲線繪制用乘積極限法(Kaplan-Meier)進(jìn)行單因素生存分析，對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)(Log-Rank test)進(jìn)行生存曲線比較，多因素分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-31在ESCC中的表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系

在81例ESCC標(biāo)本中，61例(75.31%)出現(xiàn)了相對(duì)于癌旁正常食管組織的不同程度的miR-31表達(dá)上調(diào)，20例(24.69%)表現(xiàn)出miR-31的表達(dá)下調(diào)。其中最高的表達(dá)上調(diào)489.85倍，最低的表達(dá)下調(diào)28.70倍，平均表達(dá)上調(diào)29.58倍。57例(70.37%)癌組織中的miR-31表達(dá)高于癌旁正常組織2倍以上(圖1)。3株食管癌細(xì)胞株與正常食管上皮細(xì)胞相比，miR-31均出現(xiàn)了明顯上調(diào)，其中在KYSE410中高表達(dá)110.59倍、在EC1中高表達(dá)77.05倍，而在EC9706中高表達(dá)51.92倍(圖2)。將miR-31在癌和(或)癌旁正常組織中的差異性表達(dá)倍數(shù)與臨床病理參數(shù)比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-31在腫瘤中的高表達(dá)與浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理分期有關(guān)：浸潤(rùn)深度超過肌層的食管癌組織相比未超過肌層的食管癌組織，miR-31的表達(dá)提高約27倍(P=0.002)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織相比無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織，miR-31的表達(dá)提高約4倍(P=0.043)；而miR-31在Ⅲ、Ⅳ期食管癌組織中較Ⅰ、Ⅱ期表達(dá)提高約5倍(P=0.027)。另外，miR-31的表達(dá)水平與性別、年齡、腫瘤長(zhǎng)徑、是否存在神經(jīng)浸潤(rùn)以及分化程度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，表1)。結(jié)合流行病學(xué)資料分析，miR-31與吸煙、飲酒及腫瘤家族史亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

圖 1 miR-31在ESCC組織/正常組織中的表達(dá)水平(n=81)Fig. 1 Level of miR-31 in ESCC tissue compared to normal tissue (n=81)

圖 2 miR-31在ESCC細(xì)胞株KYSE410、EC1、EC9706中的表達(dá)水平Fig. 2 Relative expression level of miR-31 in ESCC cell lines (KYSE410, EC1 and EC9706) compared to normal esophageal epithelial cells

2.2 miR-31在ESCC中的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

以miR-31在ESCC組織中表達(dá)提高是否超過2倍為標(biāo)準(zhǔn)，將所有患者分為miR-31高表達(dá)組及miR-31未高表達(dá)組。兩組間在性別、年齡、吸煙史、飲酒史及家族史等因素方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。根據(jù)電話隨訪結(jié)果，以復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或死亡代表腫瘤進(jìn)展事件，分別統(tǒng)計(jì)兩組的無進(jìn)展生存期(progression-free survival，PFS)。Kaplan-Meier分析提示，miR-31高表達(dá)組的平均PFS為(16.30±1.39)個(gè)月，而miR-31未高表達(dá)組為(20.30±1.27)個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.031，P=0.014，圖3)，說明miR-31表達(dá)未超過2倍者有顯著的無進(jìn)展生存優(yōu)勢(shì)。進(jìn)一步行Cox回歸分析顯示，miR-31表達(dá)未超過2倍者有獨(dú)立的無進(jìn)展生存優(yōu)勢(shì)(RR=2.546，95%CI:1.154～5.614，P=0.021)，而年齡、性別、侵潤(rùn)深度、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、病理分期等卻均與患者預(yù)期PFS無顯著相關(guān)性(P＞0.05)。

圖 3 不同miR-31表達(dá)水平的ESCC患者的PFSFig. 3 The progression free survival (PFS) curves according to different miR-31 expression levels in ESCC

表 1 miR-31在食管鱗癌組織中的異常表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab. 1 Relationship of miR-31’s abnormal expression and clinicopathological factors in ESCC tissues

3 討 論

許多研究表明，miRNA在調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的同時(shí)，其本身也具有癌基因或抑癌基因的特點(diǎn)。其中某些miRNA，如miR-21在大多數(shù)腫瘤中呈現(xiàn)高水平表達(dá)，并充當(dāng)癌基因的角色［5］。而miR-31卻在不同的腫瘤中存在不同水平的表達(dá)。Valastyan等［6］發(fā)現(xiàn)miR-31能介導(dǎo)乳腺癌肺部轉(zhuǎn)移灶荷瘤的減小，抑制其表達(dá)能提高乳腺癌細(xì)胞的活動(dòng)性、侵襲性及抗凋亡能力。因此研究者認(rèn)為miR-31在乳腺癌中是一種降低轉(zhuǎn)移發(fā)生率的抑癌基因。而miR-31在結(jié)腸癌中表達(dá)的提高卻促進(jìn)了腫瘤侵襲性［7］，因此又被認(rèn)為具有癌基因特點(diǎn)。

miR-31在不同腫瘤中存在截然不同的表達(dá)，這一看似矛盾現(xiàn)象在許多相關(guān)實(shí)驗(yàn)中均有報(bào)道。例如miR-31在結(jié)直腸癌［8］、肺癌［9］及口腔癌［10］中一般處于高表達(dá)水平，而在胃癌［11］、乳腺癌［12］及卵巢癌［13］中則顯著低表達(dá)。即便同是食管癌中，miR-31在腺癌和鱗癌的表達(dá)水平也不盡相同。Leidner等［14］研究Barrett化生與食管腺癌演進(jìn)關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，miR-31在腺癌和高級(jí)別異型增生組織中的表達(dá)較Barrett食管中明顯下調(diào)，因此推斷miR-31可能具有抑制食管腺癌發(fā)生的作用。而本研究卻在食管鱗癌中發(fā)現(xiàn)miR-31較正常組織表達(dá)上調(diào)，因此推測(cè)其可能具有促進(jìn)腫瘤發(fā)生的作用?？梢钥闯觯琺iR-31并非在所有腫瘤中都呈現(xiàn)高表達(dá)或低表達(dá)狀態(tài)。在鱗狀細(xì)胞癌中，miR-31大都為高表達(dá)，而在泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤中往往呈低表達(dá)。上述現(xiàn)象提示人們不能排除該基因存在組織特異性的可能［15］。若此假想成立，其原因可能是因?yàn)樗蓄愋偷募?xì)胞都具有分泌和接受miRNA的能力，同一細(xì)胞可分泌多種miRNA，而一種miRNA則能調(diào)節(jié)多個(gè)基因的翻譯。因此miR-31的信號(hào)傳遞方式可以是雙向或多向的，這與傳統(tǒng)的細(xì)胞間信號(hào)單向傳遞不同。在某特定腫瘤組織中，若miR-31調(diào)控的抑癌因素占主要地位，則miR-31展現(xiàn)出抑癌傾向；反之則展現(xiàn)出促癌傾向。對(duì)于本身不編碼蛋白的miRNA來說，其靶基因的性質(zhì)往往決定了其組織特異性。

本研究中的81例ESCC手術(shù)切除標(biāo)本中，57例(70.37%)癌組織miR-31的表達(dá)高于正常組織2倍以上，在3株食管癌細(xì)胞中的表達(dá)更是上調(diào)超過50倍。這一數(shù)據(jù)與Zhang等［16］的報(bào)道較為符合(30/45，66.7%)，進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-31在ESCC中特異性表達(dá)升高，有癌基因傾向。另外發(fā)現(xiàn)：腫瘤浸潤(rùn)越深，miR-31表達(dá)越高(P=0.002)；病理分期越晚，miR-31表達(dá)越高(P=0.027)；在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中，miR-21表達(dá)比無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中更高(P=0.043)。TNM分期是公認(rèn)的評(píng)估腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移情況以及預(yù)測(cè)預(yù)后的指標(biāo)，因此miR-31可能也具有一定的評(píng)估及預(yù)測(cè)作用。Zhang等［16］報(bào)道了miR-31與臨床病理學(xué)因素的關(guān)系，揭示miR-31在晚期腫瘤患者中表達(dá)更高。相比而言，本研究除病理分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以外，還發(fā)現(xiàn)了miR-31與侵潤(rùn)深度的關(guān)系，進(jìn)一步提示miR-31可能對(duì)ESCC的侵襲及轉(zhuǎn)移具有促進(jìn)作用。Wang等［17］報(bào)道在結(jié)直腸癌中也存在miR-31表達(dá)提高，并且其高表達(dá)與TNM分期及浸潤(rùn)深度呈正相關(guān)，這一現(xiàn)象與ESCC中相似。而另一些惡性腫瘤中則可見與本實(shí)驗(yàn)不同的結(jié)果，Zhang等［18］在胃癌中發(fā)現(xiàn)miR-31表達(dá)明顯下調(diào)，雖差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但仍可看出其下調(diào)與TNM因素呈一定的負(fù)相關(guān)。miRNA調(diào)控作為一種表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象，是否受到環(huán)境因素的影響，導(dǎo)致其靶基因發(fā)生致瘤性的改變。Xi等［19］發(fā)現(xiàn)，香煙煙霧冷凝液可誘導(dǎo)正常呼吸道上皮及肺癌組織中的miR-31表達(dá)提高，增加肺癌細(xì)胞的增殖性和致瘤性，因此認(rèn)為miR-31與吸煙史以及肺癌的發(fā)生相關(guān)。但在本研究中miR-31與吸煙、飲酒及腫瘤家族史并無明顯相關(guān)性(P＞0.05)。

有關(guān)miR-31的異常表達(dá)與腫瘤患者生存期的關(guān)系，不同的腫瘤研究結(jié)果不同。在乳腺癌中miR-31的高表達(dá)可提高患者生存時(shí)間［6］；而本研究中，高表達(dá)的miR-31不但與較差的PFS顯著相關(guān)，而且還超過了浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理分期等因素對(duì)PFS的影響，成為ESCC獨(dú)立的危險(xiǎn)因素。相比其他研究中針對(duì)總生存期進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，本研究著眼于PFS，能更為客觀地評(píng)判腫瘤相關(guān)生存水平。

綜上所述，miR-31的表達(dá)上調(diào)在ESCC中是一高頻分子事件，與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度、病理分期及不良預(yù)后顯著相關(guān)，提示miR-31可作為ESCC早期診斷及評(píng)估預(yù)后的候選指標(biāo)之一。相信隨著表觀遺傳學(xué)研究的不斷深入，有關(guān)miR-31以及更多腫瘤相關(guān)性miRNA的分子機(jī)制及臨床價(jià)值會(huì)被人們進(jìn)一步了解。

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The expression of microRNA-31 in esophageal squamous cell carcinoma and its prognostic value

LUO Jun, LING Zhi-qiang, PENG Bing-feng, YUAN Jia-min, ZHENG Zhi-guo, MAO Wei-min (Zhejiang Province Cancer Hospital, Zhejiang Cancer Research Institure, Zhejiang Key Laboratory of the Diagnosis and Treatment Technology on Thoracic Oncology, Hangzhou Zhejiang 310022, China)

LING Zhi-qiang E-mail: lingzq@hotmail.com

Background and purpose: It was reported that many microRNAs (miRNAs) have close relation with carcinomas. miR-31 (microRNA-31) shows abnormal change in numerous cancers. China is one of the most high-risk areas of esophageal squamous cell carcinoma (ESCC). The aim of the present study was to investigate the expression of miR-31 in ESCC, and analyze the relationship of its expression with clinicopathological features and prognosis. Methods: The expression of miR-31 in KYSE410, EC1 and EC9706 cell lines, as well as 81 cases of ESCC tissues and adjacent normal esophageal tissues were detected by real-time reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). The result was combined with clinical and follow-up data and statistical analysis was conducted. Results: MiR-31 was up-expression in 3 cell lines and 75.31% of the ESCC tissues. miR-31 up-expression was positively related to severer lymph node metastasis (P=0.043), deeper invasion of tumors (P=0.002) and advanced pathological stage (P=0.027). There was no relationship of miR-31 with other clinicopathological features (P＞0.05). Furthermore, high expression of miR-31 was associated with poor progression-free survival (PFS) in 81 ESCC patients by Kaplan-Meier analysis (P=0.014) and by multivariate Cox analysis (P=0.021). Conclusion: Our results identified miR-31 may be a new diagnostic criteria and prognostic biomarker for ESCC.

Esophageal squamous cell carcinoma; miR-31; Clinicopathology; Survival

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.07.002

R735.1

：A

：1007-3639(2013)07-0487-06

2013-02-25

2013-04-25）

衛(wèi)生部科研基金(No：WKJ2010-2-004)；浙江省自然基金項(xiàng)目(No：Y2091110)。

凌志強(qiáng) E-mail:lingzq@hotmail.com