馬一杰，呂慧芳，尚藝曼，羅素霞，陳小兵，顏才華

鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院(河南省腫瘤醫(yī)院)腫瘤內(nèi)科，河南鄭州450008

最新研究顯示，抑癌基因的失活不僅與基因突變等遺傳學(xué)改變有關(guān)，還與基因的表觀遺傳學(xué)調(diào)控密切相關(guān)［1-2］。甲基化、組蛋白乙酰化作為重要的基因表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制之一，受到廣泛關(guān)注［3-6］。TIP30作為受到眾多關(guān)注的抑癌基因之一，在許多研究中均已證實(shí)與結(jié)腸癌預(yù)后密切相關(guān)［7-9］。

我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，TIP30啟動(dòng)子CpG島高甲基化狀態(tài)與其基因表達(dá)密切相關(guān)，且與結(jié)腸癌細(xì)胞對5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑的化療敏感性高度相關(guān)［10-11］。本實(shí)驗(yàn)旨在前期研究的基礎(chǔ)上，通過TIP30基因在結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116和HT29中藥物干預(yù)前后的表達(dá)，探討甲基化及乙?；瘜υ撘职┗虮磉_(dá)的調(diào)控以及伊立替康(CPT-11)敏感性的改變，從而探討結(jié)腸癌的發(fā)生機(jī)制，并為結(jié)腸癌為個(gè)體化治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116及HT29購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心，注射用鹽酸伊立替康(億邁林)購自齊魯制藥(海南)有限公司，5-aza-2＇-deoxy-cytidine(DAC)、Trichostatin A(TSA)購自 Sigma，總RNA抽提試劑Trizol購自Invitrogen，RT-PCR試劑盒購自Promega公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116、HT29，含20 ml/L小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中無菌培養(yǎng)，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。

1.2.2 試驗(yàn)分組:對照組:同期培養(yǎng)不加藥的結(jié)腸癌細(xì)胞;實(shí)驗(yàn)組:(1)DAC組:加 5 μmol/L DAC培養(yǎng)72 h;(2)TSA組:加TSA 300 nmol/L培養(yǎng)24 h;(3)聯(lián)合組:加5 μmol/L DAC培養(yǎng)48 h后加TSA 300 nmol/L繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.3 RT-PCR檢測各組TIP30基因的mRNA表達(dá):購自Invitrogen公司的Trizol試劑盒，依說明書進(jìn)行結(jié)腸癌HCT116及HT29細(xì)胞總RNA抽提，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的基因。上游引物5＇-GTCTTTATTTTGGGCGCCAG-3＇，下游引物5＇-CCCAGCTTTCCCTCTGGTGG-3＇，內(nèi)參照由TaKaRa公司合成，上游引物5＇-GCCTCC GGCA GGACCACCGG-3＇，下游引物 5＇-CGGTGAGATCGCG GCCCGCC-3＇。

1.2.4 檢測結(jié)腸癌細(xì)胞對CPT-11的敏感性:分別取HCT116及HT29對照組和DAC組對數(shù)生長期細(xì)胞，將1×104/ml的結(jié)腸癌細(xì)胞接種于96孔板，24 h后加入不同濃度的CPT-11，同時(shí)設(shè)陰性對照組和空白對照組。48 h后，每孔加入MTT 150 μl。4 h后離心，棄去液體，每孔加入DMSO 100 μl。10 min后，全自動(dòng)酶標(biāo)儀測吸光度A，計(jì)算生長抑制率，繪制生長抑制曲線，確定結(jié)腸癌細(xì)胞不同組別的CPT-11半數(shù)抑制濃度(IC50)。

2 結(jié)果

2.1 HT29和HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞經(jīng) DAC或/和TSA處理前后TIP30 mRNA在結(jié)腸癌細(xì)胞中表達(dá)水平的變化 RT-PCR結(jié)果示:HT29細(xì)胞TIP30 mRNA在經(jīng)藥物處理前mRNA低表達(dá)，經(jīng)TSA處理后表達(dá)較前無明顯變化，經(jīng)DAC處理后有較強(qiáng)表達(dá)，經(jīng)DAC+TSA處理后與DAC單藥干預(yù)效果相似。HCT116細(xì)胞TIP30 mRNA在經(jīng)藥物處理前mRNA不表達(dá)，經(jīng)TSA處理后仍表達(dá)缺失，經(jīng)DAC處理后由不表達(dá)變?yōu)檩^強(qiáng)表達(dá)，經(jīng)DAC+TSA處理后與DAC單藥干預(yù)效果相似(見圖1)。

結(jié)腸癌細(xì)胞對 CPT-11的敏感性 CPT-11對HCT116及 HT29細(xì)胞的生長抑制曲線見圖 2。HCT116及HT29細(xì)胞的IC50(半效抑制濃度)分別為38.4 μg/ml和 19.6 μg/ml，DAC 處理后分別為 13.1 μg/ml和 5.2 μg/ml。

3 討論

表觀遺傳學(xué)是基因的DNA序列不發(fā)生改變的情況下，基因的表達(dá)水平與功能發(fā)生改變，并產(chǎn)生可遺傳的表型。DNA甲基化和組蛋白乙酰化是哺乳動(dòng)物最重要的兩種表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制，大量基礎(chǔ)研究顯示，其在包括結(jié)腸癌在內(nèi)的多種腫瘤病理生理過程中發(fā)揮著重要作用［12-14］。

DAC是一種嘧啶類藥物，能夠通過和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶形成復(fù)合物抑制其活性，實(shí)現(xiàn)去甲基化。TSA則是一種組蛋白去乙?；D(zhuǎn)移酶(HDACs)抑制劑，能夠抑制 HDACs活性，實(shí)現(xiàn) DNA組蛋白高乙?；?。TIP30基因是近年新發(fā)現(xiàn)的一種與腫瘤轉(zhuǎn)移抑制相關(guān)的基因。既往研究發(fā)現(xiàn)，TIP30基因在包括大腸癌在內(nèi)的多種腫瘤組織中表達(dá)下降或缺失，提示TIP30基因表達(dá)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。張霞等［8］采用回顧性分析方法，檢測了46例結(jié)直腸癌中TIP30蛋白及P53蛋白的表達(dá)水平，分析研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)癌組織中TIP30蛋白表達(dá)水平明顯低于癌旁組織，并且表達(dá)水平與腫瘤臨床分期和侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。Li等［9］用RT-PCR法檢測30例結(jié)直腸癌、結(jié)直腸腺瘤及配對正常腸組織中TIP30基因表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)TIP30 mRNA的表達(dá)率與腫瘤的惡性程度呈反比(正常腸黏膜:96.7%;腺瘤:83%;結(jié)直腸癌:23.3%)，其表達(dá)水平與腫瘤的生長呈反比。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在腺瘤組織及癌組織中，TIP30基因表達(dá)水平均與細(xì)胞凋亡率呈正相關(guān)(r結(jié)直腸腺瘤=0.288，t=0.035)。這一研究提示TIP30基因可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡從而發(fā)揮抗腫瘤作用。我們前期研究同樣發(fā)現(xiàn)［15］，人結(jié)腸癌組織中抑癌基因TIP30的表達(dá)下降與其啟動(dòng)子的高甲基化有關(guān)，TIP30啟動(dòng)子甲基化在結(jié)腸癌組織里普遍存在，而在正常結(jié)腸黏膜組織中則很少出現(xiàn)。TIP30啟動(dòng)子高甲基化與結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、CEA水平及臨床分期呈正相關(guān)。

在既往研究的基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步探討乙?；赥IP30表達(dá)下降中的調(diào)控作用，以及其與甲基化是否存在協(xié)同作用，我們進(jìn)行了本研究。結(jié)果顯示，DAC干預(yù)能夠逆轉(zhuǎn)TIP30基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，使該基因重新表達(dá)或表達(dá)增加，而TSA組則效果較差，聯(lián)合用藥與DAC單藥干預(yù)效果相似，這再次證實(shí)在結(jié)腸癌HCT116和HT29細(xì)胞中導(dǎo)致TIP30沉默的主要原因?yàn)镈NA甲基化，而乙?；诔聊琓IP30表達(dá)方面與去甲基化無明顯協(xié)同作用。同時(shí)，HCT116及HT29對CPT-11的化療敏感性存在差異，甲基化水平更高的HCT116細(xì)胞系與HT29相比CPT-11敏感性更差，經(jīng)DAC處理后，二者對CPT-11敏感性增加，提示TIP30啟動(dòng)子高甲基化狀態(tài)不僅是預(yù)后的不良指標(biāo)，更可能是化療療效不佳的預(yù)測指標(biāo)。

以上結(jié)果提示，結(jié)腸癌發(fā)病及其藥物敏感性不僅與基因突變、基因缺失等經(jīng)典遺傳學(xué)有關(guān)，還與DNA甲基化等表觀遺傳學(xué)有關(guān)。深入研究DNA甲基化與腫瘤預(yù)后及療效預(yù)測的關(guān)系及作用機(jī)制，可能成為結(jié)腸癌早期診斷及指導(dǎo)臨床決策的依據(jù)之一，為個(gè)體化治療提供了可能。然而，這仍有待進(jìn)一步深入驗(yàn)證，個(gè)體化治療之路，任重而道遠(yuǎn)。

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