羅曉莉 周耀芳

廣州中醫(yī)藥大學(xué)青蒿研究中心生物技術(shù)室，廣東 廣州 510405

青蒿反義鯊烯合酶基因植物表達(dá)載體PBI121－SS的構(gòu)建

羅曉莉 周耀芳

廣州中醫(yī)藥大學(xué)青蒿研究中心生物技術(shù)室，廣東 廣州 510405

目的：利用基因工程對(duì)野生青蒿進(jìn)行人工操縱來提高其青蒿素生產(chǎn)能力。方法：從已有載體pROKII－SS通過PCR獲得鯊烯合酶基因（SS），然后連接pMD－18載體，測(cè)序后，酶切，連接表達(dá)載體PBI121－SS，通過菌液PCR，抽取質(zhì)粒，酶切檢測(cè)。結(jié)果：通過上述方法植物表達(dá)載體PBI121－SS構(gòu)建成功，并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404。

青蒿素；反義基因；載體構(gòu)建

青蒿素（artemisinin）是我國(guó)科學(xué)家從傳統(tǒng)抗瘧中藥——菊科蒿屬的青蒿（Artemisia annua L.）中分離提純出的含有過氧橋結(jié)構(gòu)的類異戊二烯化合物。其合成的衍生物還有雙氫青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚、蒿乙醚等，它們?cè)诏懠仓委熒暇哂懈咝А⑺傩Ш偷投镜忍攸c(diǎn)，已成為瘧疾流行地區(qū)的“靈丹妙藥”?？墒浅噍锿?，尚未發(fā)現(xiàn)含有青蒿素的其它天然植物資源。青蒿雖然系世界廣布品種，但青蒿素含量隨產(chǎn)地不同差異極大，且含量?jī)H占葉片干重的0.5%左右，最多也不超過1%。本研究擬在克隆青蒿鯊烯合酶基因（SS）的基礎(chǔ)上，利用根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒衍生的雙元載體系統(tǒng)構(gòu)建反義SS基因表達(dá)載體，然后利用實(shí)驗(yàn)方法轉(zhuǎn)化青蒿外植體和再生轉(zhuǎn)基因植株，通過阻遏青蒿內(nèi)源SS基因表達(dá)以降低類固醇的合成并將碳流引向青蒿素合成的可能性，最終提高青蒿素含量。

1 材料

1.1 菌種和質(zhì)粒 大腸桿菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存；pMD－18 T載體購(gòu)自TaKaRa公司；pROKII－SS載體本實(shí)驗(yàn)保存；PBI121載體由本校熱研所提供；根癌農(nóng)桿菌LBA4404（pAL4404）菌株載體購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 試劑 質(zhì)粒DNA純化試劑盒、DNA片段回收試劑盒購(gòu)自Life Technologies公司；聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)（RT－PCR）擴(kuò)增試劑盒、Taq酶、限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶購(gòu)自Takara公司。培養(yǎng)基成分及其他常規(guī)化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.3 儀器 PCR儀；臺(tái)式離心機(jī)；凝膠成像分析系統(tǒng)；臺(tái)式制冷機(jī)；高速冷凍離心機(jī)；恒溫振蕩器；微型凝膠電泳儀；紫外分析儀；壓力蒸氣消毒器；電熱恒溫水浴鍋；超凈工作臺(tái)；脫色搖床；旋渦混合器。

2 方法

2.1 PCR擴(kuò)增 以實(shí)驗(yàn)室的pROKII－SS載體為模板，帶有酶切位點(diǎn)的SmaI－SS（5′TCCCCCGGGATGAGTAGTTTGAAAG3′）、BamHI－SS（5′CGCGGATCCTTACAAAGTGAATTC3′）為上下引物，對(duì)pROKII－SS進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：94℃，1分鐘→94℃，30秒，后57℃，1分鐘，然后72℃，1.5分鐘，30個(gè)循環(huán)→72℃，10分鐘→4℃。反應(yīng)結(jié)束后，取5～10μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。

2.2 擴(kuò)增片段回收 長(zhǎng)波紫外觀看凝膠，切下含擴(kuò)增片段的瓊脂糖部分，將凝膠放入eppendorf管中，按試劑盒說明書操作。以回收的純化擴(kuò)增產(chǎn)物調(diào)制下列連接反應(yīng)：1μl solution I、1μl pMD－18 T載體、5μl PCR產(chǎn)物，3μl H2O、16℃反應(yīng)過夜。

2.3 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化 加入3～5μl連接產(chǎn)物至感受態(tài)細(xì)胞，混勻，冰浴30分鐘；42℃熱激90秒，迅速冷卻1～2分鐘，加入1m l LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1.5h；取200μl菌液涂于含100mg／L Amp的篩選平板上，吹干，37℃倒置培養(yǎng)12～16小時(shí)。

2.4 重組質(zhì)粒鑒定 挑取單菌落，搖菌并提取質(zhì)粒，分別經(jīng)PCR擴(kuò)增及SmaI，BamHI酶切鑒定。PCR擴(kuò)增采用Taq酶，反應(yīng)條件為：94℃，1分鐘→94℃，30秒，后57℃，1分鐘，然后72℃，1.5分鐘，30循環(huán)→72℃，10分鐘→4℃。DNA酶切反應(yīng)條件（30μl體系）：1.0－2.0μg質(zhì)粒DNA、3μl 10×T緩沖液、SmaI 1.5μl，BamHI 1.5μl，加ddH2O至終體積30μl，置30℃反應(yīng)2～3小時(shí)。

2.5 重組質(zhì)粒測(cè)序 重組后的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，核對(duì)為反義基因SS且序列正確無(wú)誤。

2.6 目的基因與超表達(dá)載體的酶切 經(jīng)測(cè)序后確認(rèn)SS無(wú)誤后，將pMD18－SS質(zhì)粒和PBI121質(zhì)粒用SmaI，BamHI做雙酶切，酶切體系為（30μl體系）：1.0～2.0μg質(zhì)粒DNA、3μl 10×T緩沖液、SmaI 1.5μl，BamHI 1.5μl，加ddH2O至終體積30μl，置30℃反應(yīng)2～3小時(shí)。

2.7 目的基因與超表達(dá)載體的連接 經(jīng)雙酶切的目的基因和表達(dá)載體，用純化試劑盒純化后，進(jìn)行連接，連接體系（10μl體系）：200ng SS片段、250ng PBI121質(zhì)粒，1μl 10 ×連接緩沖液、1U T4DNA連接酶，加ddH2O至終體積10μl，置16℃反應(yīng)過夜。

2.8 大腸桿菌轉(zhuǎn)化與鑒定 方法同2.3和2.4。

2.9 農(nóng)桿菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化與鑒定 低溫冰箱中取出100μl感受態(tài)細(xì)胞懸液，室溫解凍，立即置冰上，加0.1μg PBI121－SSDNA溶液，輕混勻，冰上放置10分鐘。置于液氮速凍5分鐘，28℃水浴熱激5分鐘。加入500μl YEB液體培養(yǎng)基，28℃緩慢振蕩培養(yǎng)2～3小時(shí)，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)。取上述菌液100μl涂布于含Rif（50μg／m l）及Kan（25μg／m l）的YEB篩選平板上，放置30分鐘，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，28℃培養(yǎng)24～48小時(shí)。經(jīng)PCR擴(kuò)增鑒定陽(yáng)性克隆。

3 結(jié)果

3.1 青蒿SSDNA擴(kuò)增 載體Prok II－SS經(jīng)PCR擴(kuò)增后，經(jīng)10%凝膠電泳可見一條長(zhǎng)度約1250bp的帶。由電泳結(jié)果可知，青蒿SS基因已從載體Prok II－SS中擴(kuò)增出來，其大小符合理論長(zhǎng)度。見圖1。

3.2 目的基因與載體的連接 將PCR擴(kuò)增片段插入pMD18－T載體后獲得的重組質(zhì)粒命名為pMD18－SS。抽取pMD18－SS的質(zhì)粒做雙酶切，經(jīng)1%凝膠電泳后，可見與青蒿DNA的PCR產(chǎn)物大小相當(dāng)?shù)膮^(qū)帶，表明上述擴(kuò)增片段已經(jīng)與載體連接。見圖2。

3.3 反義SS基因超表達(dá)載體PCR鑒定 將經(jīng)過雙酶切連接重組后質(zhì)粒命名為PBI121－SS，將其導(dǎo)入大腸桿菌DH5α后提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示SSDNA片段已擴(kuò)增，說明PBI121－SS已連接成功。見圖3。

3.4 反義SS基因超表達(dá)載體雙酶切鑒定 將PBI121－SS質(zhì)粒用SmaI，BamHI做雙酶切進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定，結(jié)果顯示切下的片段與SS基因片段大小一致，說明PBI21－SS超表達(dá)載體已經(jīng)構(gòu)建成功。見圖4。

3.5 反義SS基因超表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌鑒定 使用凍融法將PBI121－SS導(dǎo)入農(nóng)桿菌BA4404，以農(nóng)桿菌DNA為模板PCR，結(jié)果擴(kuò)增出1259 bp的反義SS基因片段，說明PBI121－SS質(zhì)粒已導(dǎo)入農(nóng)桿菌。見圖5。

4 討論

目前，采用基因工程手段培育高產(chǎn)青蒿素品系正在受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注［1－4］。國(guó)內(nèi)外相繼開展了青蒿素生物合成關(guān)鍵酶基因克隆的研究，已克隆出從乙酰CoA合成FDP的關(guān)鍵酶基因，即HMG－CoA還原酶基因（HMGR）和FDP合酶基因（FDPS）。Chen等利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化分別獲得轉(zhuǎn)FDPS基因青蒿發(fā)根和青蒿植株，其青蒿素含量比非轉(zhuǎn)基因青蒿植株提高了2－3倍［2－3］。由此可見，植物基因工程在青蒿素高產(chǎn)品系的培育上具有很大潛力。

pMD18－T Vector是一種高效克隆PCR的專用載體，由pUC18載體改建而成的，消除了pUC18載體上的多克隆酶切位點(diǎn)，再在pUC18載體的多克隆酶切位點(diǎn)處導(dǎo)入了EcoR V酶切位點(diǎn)，使用EcoR V進(jìn)行酶切反應(yīng)后，再在兩側(cè)的3′端添加“T”構(gòu)成?？寺『蟮腜CR產(chǎn)物無(wú)法將載體上的限制酶切下，需要在PCR擴(kuò)增引物中導(dǎo)入合適的酶切位點(diǎn)，此時(shí)如果使用PCR擴(kuò)增引物導(dǎo)入的酶切位點(diǎn)進(jìn)行DNA酶切時(shí)，酶切反應(yīng)將不會(huì)受T載體上其他多克隆酶切位點(diǎn)上的限制酶影響，可以大大提高酶切效率，增加亞克隆成功率。

本次實(shí)驗(yàn)在青蒿細(xì)胞中導(dǎo)入反義SS基因，嘗試通過干擾SS基因表達(dá)來降低類固醇合成活性［6］。因此，以雙元質(zhì)粒pBI121為基礎(chǔ)構(gòu)建反義SS基因表達(dá)載體PBI121－SS，然后利用根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒衍生載體，在后續(xù)研究中將反義SS基因?qū)肭噍锛?xì)胞并再生轉(zhuǎn)基因青蒿植株，試圖使青蒿體內(nèi)的代謝活動(dòng)朝著更有利于青蒿素合成的方向轉(zhuǎn)變，從而實(shí)現(xiàn)青蒿分子育種的目標(biāo)，并為利于植物基因工程改造中藥材進(jìn)行有益的探索。

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R284

A

1007－8517（2013）21－0005－02

2013.09.20）

柬埔寨那塔納基里快速滅源滅瘧示范項(xiàng)目（KY－2011－013－4）。

羅曉莉，女，碩士，E－mail：117231216＠qq.com