廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院腫瘤科，廣東 廣州 510260

CCL18通過(guò)促進(jìn)整合素的聚集增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞黏附于細(xì)胞外基質(zhì)

陳靜琦 朱必勝 侯開(kāi)連

廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院腫瘤科，廣東 廣州 510260

背景與目的：在乳腺癌微環(huán)境中，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor associated macrophages，TAMs)分泌CCL18，CCL18與病人的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。本文旨在探討來(lái)源于TAMs的CCL18是否能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞黏附于細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，進(jìn)一步闡明CCL18促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞黏附于ECM的分子機(jī)制。方法：在無(wú)血清培養(yǎng)體系中，用纖粘連蛋白包被培養(yǎng)板，用黏附實(shí)驗(yàn)的方法檢測(cè)CCL18對(duì)乳腺癌SK-3rd細(xì)胞黏附于ECM的作用；用免疫熒光的方法檢測(cè)CCL18對(duì)SK-3rd細(xì)胞表面整合素的影響。結(jié)果：CCL18通過(guò)引起乳腺癌SK-3rd細(xì)胞表面整合素的聚集，導(dǎo)致乳腺癌SK-3rd細(xì)胞黏附于ECM的數(shù)量明顯增多。結(jié)論：CCL18通過(guò)促進(jìn)整合素聚集而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞黏附于ECM。

乳腺癌；CCL18；黏附；細(xì)胞外基質(zhì)；整合素

黏附在乳腺癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起關(guān)鍵的作用［1］，在這個(gè)過(guò)程中癌細(xì)胞與基質(zhì)的黏附主要是由黏附分子介導(dǎo)的，細(xì)胞與細(xì)胞或細(xì)胞與基質(zhì)之間的黏附反應(yīng)過(guò)程類似于配體與受體的結(jié)合反應(yīng)，細(xì)胞表面的黏附分子類似于受體的作用。當(dāng)細(xì)胞間發(fā)生黏附時(shí)，與細(xì)胞表面黏附分子結(jié)合的配體可能是位于另一個(gè)細(xì)胞上相同或不同的黏附分子；而在細(xì)胞與基質(zhì)間的黏附反應(yīng)中，其配體則是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)。在黏附反應(yīng)發(fā)生時(shí)，通常是位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的黏附分子功能區(qū)首先啟動(dòng)，通過(guò)黏附分子胞外連接區(qū)(受體)與相應(yīng)的配體結(jié)合，形成黏附分子-配體結(jié)構(gòu)，由此引起受體構(gòu)象的變化誘發(fā)了配體的生物信息，而與黏附分子(受體)相連的細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白將配體的信號(hào)跨膜傳到細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)一步影響細(xì)胞與ECM之間、細(xì)胞與細(xì)胞間的黏附［2］。

ECM中的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor associated macrophages，TAMs)所分泌的生物活性因子顯著影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性［3］。體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)證明TAM通過(guò)分泌CCL18促進(jìn)乳腺癌浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移［4］。乳腺癌細(xì)胞間的黏附降低以及其與ECM的黏附增強(qiáng)在腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵的作用，為了闡明CCL18促進(jìn)乳腺癌浸潤(rùn)、遷移的機(jī)制，本文深入研究CCL18在乳腺癌細(xì)胞黏附過(guò)程中的作用，從而證明CCL18引起乳腺癌浸潤(rùn)、遷移的起始步驟可導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞黏附功能的變化。

1 材料和方法

1.1 材料

利用從ATCC購(gòu)買的乳腺癌SKBR3細(xì)胞系構(gòu)建SK-3rd細(xì)胞系；從廣州市血液中心取正常成人外周血白細(xì)胞；transwell培養(yǎng)板購(gòu)于Corning公司，微孔直徑為0.4 μm；纖粘連蛋白購(gòu)于美國(guó)Roche公司；IL-4購(gòu)于R&D公司；細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)于Corning公司；CCL18蛋白和CCL18中和性抗體購(gòu)于R&D公司；整合素α5β1抗體購(gòu)于美國(guó)Millipore公司；靶向整合素β1基因的siRNA由上海吉瑪公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

在完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清的DMEM)中培養(yǎng)SK-3rd細(xì)胞。人單核細(xì)胞取自廣州血液中心健康志愿者外周血的單個(gè)核細(xì)胞。人外周血單個(gè)核細(xì)胞鋪在Ficoll-Hypaque(Pharmacia Corporation，Peapack，N.J.)上層，用密度梯度離心法進(jìn)一步分離去除紅細(xì)胞，以2×106/mL接種于6孔板或24孔板，在DMEM(Gibco)完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37 ℃溫育2 h 后，反復(fù)洗去懸浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d后，用加入含45 ng/mL人IL-4的新鮮完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，激活單核細(xì)胞。在第7天獲得IL-4激活的巨噬細(xì)胞(M2)。

1.2.2 黏附實(shí)驗(yàn)

檢測(cè)巨噬細(xì)胞對(duì)乳腺癌細(xì)胞的黏附作用：在共培養(yǎng)前24 h，消化收集誘導(dǎo)成功的M2，以1×106/mL的細(xì)胞密度加入直徑為0.4 μm的transwell的上層小室內(nèi)，把培養(yǎng)基換為含有B27、胰島素和牛血清白蛋白的DMEM-F12無(wú)血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。用纖粘連蛋白(40 μg/mL)包被另外一塊6孔板，4 ℃過(guò)夜。包被的6孔板在PBS中再水化，用10% BSA 37 ℃、溫育1 h，封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。把上述培養(yǎng)巨噬細(xì)胞的transwell的上層小室以及整個(gè)培養(yǎng)體系移入包被纖粘連蛋白孔板中，下層加入SK-3rd乳腺癌細(xì)胞(1×106/mL)，同時(shí)加入CCL18的中和性抗體10 μg/mL、5 μg/mL、CCL18中和性抗體的同型對(duì)照10 μg/mL，觀察1 h后用PBS輕輕漂洗3次，對(duì)黏附的細(xì)胞用多聚甲醛固定，用結(jié)晶紫(0.005%)染色黏附細(xì)胞。隨機(jī)選取10個(gè)400倍視野，相差顯微鏡下計(jì)數(shù)、拍照，獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

檢測(cè)CCL18促乳腺癌SK-3rd細(xì)胞的黏附作用：胰酶消化收集SK-3rd細(xì)胞，配制含有B27、胰島素和牛血清白蛋白的DMEM-F12的無(wú)血清培養(yǎng)基，用無(wú)血清培養(yǎng)基懸浮SK-3rd細(xì)胞。用纖粘連蛋白(40 μg/mL)包被6孔板，4 ℃過(guò)夜。包被的6孔板在PBS中再水化，用10% BSA 37 ℃、溫育1 h，封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，然后加入用CCL18 (20 ng/mL)處理的SK-3rd乳腺癌細(xì)胞(1×106/mL)和無(wú)血清培養(yǎng)基，觀察1 h后用PBS輕輕漂洗3次，對(duì)黏附的細(xì)胞用多聚甲醛固定，用結(jié)晶紫(0.005%)染色黏附細(xì)胞。隨機(jī)選取10個(gè)400倍視野，相差顯微鏡下計(jì)數(shù)、拍照，獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 免疫熒光實(shí)驗(yàn)

為了確定CCL18促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞整合素聚集的作用，從而闡明CCL18促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞黏附的機(jī)制，本研究用CCL18(20 ng/mL)、CCL20(20 ng/mL)分別處理無(wú)血清培養(yǎng)基懸浮SK-3rd細(xì)胞50 min，然后洗滌收集細(xì)胞，作細(xì)胞涂片，用4%多聚甲醛固定15 min后，PBST(PBS加入0.05%吐溫20)洗滌，用含有2% BSA的PBST封閉液，封閉1 h，去除封閉液后加入鼠抗人整合素α5β1一抗，PBST洗滌后，加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠熒光二抗室溫溫育30 min，PBST沖洗后，加入含有DAPI的抗粹滅劑后封片。在共聚焦顯微鏡下觀察拍片。

1.2.4 靶向整合素β1的siRNA轉(zhuǎn)染

胰酶消化SK-3rd細(xì)胞，用含10% FBS的DMEM (Gibco)懸浮細(xì)胞，37 ℃放置。使siPoRT NeoFX轉(zhuǎn)染試劑(Ambion)和OPTI-MEM I 培養(yǎng)基(Invitrogen)恢復(fù)至室溫。根據(jù)說(shuō)明書(shū)溶解siPORT NeoFX在OPTI-MEM I 培養(yǎng)基中，常溫下溫育10 min。把合成的靶向整合素β1基因的siRNA按所需的終濃度(30 nmol/L)溶解在OPTI-MEM I培養(yǎng)基中?；旌先芙獾膕iRNA和轉(zhuǎn)染試劑，常溫下溫育10 min，把混合液加入培養(yǎng)板，再把細(xì)胞懸液加到轉(zhuǎn)染混合物上面，輕搖培養(yǎng)板。轉(zhuǎn)染siRNA后的細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱中、37 ℃培養(yǎng)條件下培養(yǎng)48 h，然后用于黏附實(shí)驗(yàn)。靶向整合素β1基因的siRNA-1正義鏈：5’-GGAAAUGGUGUUUGCAAGU-3’，反義鏈：5’-ACUUGCAAACACCAUUUCC-3’，靶向整合素β1基因的siRNA-2正義鏈：5’-AAUGUAACCAACCGUAGCATT-3’，反義鏈：5’-ACUUGCAAACACCAUUUCC-3’。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件行t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析黏附的細(xì)胞數(shù)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 M2通過(guò)CCL18促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞黏附于ECM

在選擇性激活狀態(tài)的M2與乳腺癌SK-3rd細(xì)胞共培養(yǎng)體系中加入CCL18的中和性抗體，檢測(cè)CCL18在M2促乳腺癌細(xì)胞黏附于ECM中的作用。結(jié)果顯示，M2促進(jìn)乳腺癌SK-3rd細(xì)胞黏附于ECM，在共培養(yǎng)體系中加入CCL18的中和性抗體可以劑量依賴性地抑制M2促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞黏附的作用，當(dāng)加入CCL18中和性抗體5 μg/mL時(shí)，黏附細(xì)胞數(shù)降低25%；當(dāng)加入中和性抗體10 μg/mL時(shí)，黏附細(xì)胞數(shù)降低75%，而CCL18中和性抗體的同型對(duì)照(10 μg/mL)沒(méi)有抑制黏附的作用。說(shuō)明M2通過(guò)CCL18促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞系黏附于ECM (圖1)，CCL18在SK-3rd細(xì)胞黏附于ECM的過(guò)程中起關(guān)鍵的作用。

圖 1 M2通過(guò)分泌CCL18促進(jìn)乳腺癌SK-3rd細(xì)胞黏附于ECMFig. 1 M2 promoted breast cancer SK-3rdcells to adherence on fibronectin of ECM

2.2 CCL18促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞黏附于ECM

用懸浮培養(yǎng)基懸浮對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SK-3rd細(xì)胞，制成密度為106/mL的細(xì)胞懸液，用20 ng/mL的CCL18處理SK-3rd細(xì)胞50 min，在包被纖粘連蛋白的培養(yǎng)板中做黏附實(shí)驗(yàn)，分為CCL18處理組和未處理組觀察CCL18對(duì)SK-3rd細(xì)胞黏附于ECM的作用。結(jié)果表明，CCL18處理組SK-3rd細(xì)胞黏附的數(shù)量明顯增多，與未處理組相比約增多5倍(P＜0.01)。提示CCL18促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞黏附于ECM (圖2)。

2.3 CCL18促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞表面整合素α5β1聚集

整合素是在細(xì)胞黏附過(guò)程中起關(guān)鍵作用的黏附分子。為了研究CCL18促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞黏附的機(jī)制，我們用免疫熒光的方法，觀察CCL18對(duì)乳腺癌細(xì)胞表面整合素α5β1聚集的影響，結(jié)果表明CCL18能夠明顯引起乳腺癌SK-3rd細(xì)胞表面整合素α5β1聚集，而CCL20沒(méi)有促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞整合素聚集的作用(圖3)。CCL18引起整合素的聚集啟動(dòng)了乳腺癌細(xì)胞與ECM纖粘連蛋白的結(jié)合，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞浸潤(rùn)、遷移。

圖 2 CCL18 促進(jìn)乳腺癌SK-3rd細(xì)胞黏附于細(xì)胞外基質(zhì)纖粘連蛋白Fig. 2 CCL18 promoted breast cancer SK-3rdcells to adherence on fibronectin of ECM

圖 3 CCL18促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞表面整合素聚集Fig. 3 CCL18 promotes integrin aggregation on breast cancer cells

2.4 CCL18通過(guò)整合素促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞黏附

在證明CCL18可以引起整合素在乳腺癌細(xì)胞表面聚集的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步把針對(duì)整合素β1的siRNA通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入乳腺癌細(xì)胞，經(jīng)過(guò)48 h培養(yǎng)后，沉默整合素β1的表達(dá)，檢測(cè)CCL18促進(jìn)乳腺癌SK-3rd細(xì)胞黏附于ECM的情況。結(jié)果顯示，CCL18促進(jìn)乳腺癌SK-3rd細(xì)胞黏附于ECM，轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白(GFP)siRNA或單純加入脂質(zhì)體(mock)沒(méi)有影響CCL18促乳腺癌細(xì)胞黏附的作用，轉(zhuǎn)染靶向整合素β1的siRNA-1和siRNA-2可以抑制CCL18促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞黏附的作用(圖4，P＜0.001)，說(shuō)明CCL18通過(guò)促進(jìn)整合素的聚集增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞黏附于ECM，闡明了CCL18促黏附的機(jī)制。

圖 4 CCL18通過(guò)整合素促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞黏附于細(xì)胞外基質(zhì)纖粘連蛋白Fig. 4 CCL18 promoted breast cancer cells to adherence on fibronectin of ECM via integrin

3 討 論

在腫瘤組織微環(huán)境中，TAM促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，與患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，主要闡明的是TAM的數(shù)量與患者預(yù)后的關(guān)系［5］，但TAM促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的機(jī)制還不清楚。CCL18是TAM所分泌的標(biāo)志性趨化因子之一，Chenivess等［6］的研究認(rèn)為，CCL18對(duì)T、B、DC、單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生趨化作用。在研究CCL18對(duì)乳腺癌作用過(guò)程中，我們利用M2表型和功能與TAM相似、分泌大量的CCL18，建立了M2與乳腺癌細(xì)胞的共培養(yǎng)模型，模擬乳腺癌組織微環(huán)境，在說(shuō)明M2促進(jìn)乳腺癌浸潤(rùn)和遷移的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步在培養(yǎng)體系中加入CCL18的中和性抗體或用siRNA沉默M2中CCL18表達(dá)可以抑制M2促進(jìn)乳腺癌浸潤(rùn)、遷移的作用，這就充分說(shuō)明M2是通過(guò)CCL18來(lái)促進(jìn)乳腺癌的浸潤(rùn)和遷移，而不是通過(guò)其他的蛋白因子［4］。本研究結(jié)果與Schutyser等［7］的研究結(jié)果相符。

腫瘤轉(zhuǎn)移是指惡性腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)腫瘤，通過(guò)浸潤(rùn)在間質(zhì)中生長(zhǎng)，并突破脈管系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)達(dá)到靶組織，再穿透毛細(xì)血管或毛細(xì)淋巴管，達(dá)到繼發(fā)組織或器官繼續(xù)增殖生長(zhǎng)，形成與原發(fā)腫瘤相同性質(zhì)的繼發(fā)腫瘤的全過(guò)程。其中腫瘤細(xì)胞從原發(fā)癌巢中脫離是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟［8］，腫瘤細(xì)胞與周圍的黏附變化以及自身的運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)在這個(gè)過(guò)程中起重要的作用。黏附包括細(xì)胞與細(xì)胞間的黏附和細(xì)胞與ECM的黏附， 細(xì)胞與ECM的作用增強(qiáng)給予細(xì)胞遷移向前的動(dòng)力。在腫瘤微環(huán)境中促進(jìn)腫瘤運(yùn)動(dòng)的因素很多，其中包括：自分泌運(yùn)動(dòng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子。這些運(yùn)動(dòng)因子影響腫瘤細(xì)胞表面受體的分布，并調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)過(guò)程中細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與基質(zhì)間的結(jié)合。這種調(diào)節(jié)可能是通過(guò)改變受體與配體結(jié)合密度來(lái)協(xié)調(diào)細(xì)胞黏附和去黏附的周期過(guò)程。這個(gè)過(guò)程包括腫瘤細(xì)胞受體與周圍基質(zhì)中配體結(jié)合，配體-受體結(jié)合是調(diào)控信號(hào)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞支架移動(dòng)和細(xì)胞偽足樣伸展［9］。正是根據(jù)上述研究成果，我們?cè)诘玫絋AM通過(guò)分泌CCL18促進(jìn)乳腺癌浸潤(rùn)、遷移的肯定性結(jié)論后，考慮到CCL18可能是通過(guò)改變?nèi)橄侔┘?xì)胞的黏附功能和自身的運(yùn)動(dòng)能力而使其浸潤(rùn)、遷移作用增強(qiáng)。本研究利用M2與乳腺癌細(xì)胞的共培養(yǎng)模型，證實(shí)M2促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞與ECM纖粘連蛋白的黏附，在共培養(yǎng)體系中加入CCL18的中和性抗體可以抑制M2促SK-3rd黏附功能，說(shuō)明M2是通過(guò)CCL18的作用來(lái)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞黏附的，進(jìn)一步證明在SK-3rd的培養(yǎng)體系中，CCL18促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞與ECM的黏附增強(qiáng)。本研究還證實(shí)CCL18可以引起乳腺癌細(xì)胞表面整合素α5β1的聚集；用siRNA沉默乳腺癌細(xì)胞整合素β1的表達(dá)，可以抑制CCL18促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞黏附的作用，初步揭示了CCL18通過(guò)促進(jìn)整合素的聚集增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞黏附于ECM，為進(jìn)一步研究CCL18生物學(xué)作用的分子機(jī)制打下了基礎(chǔ)。

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CCL18 promotes breast cancer cells adherence on extracellular matrix mediated by integrin aggregation

CHEN Jing-qi, ZHU Bi-sheng, HOU Kai-lian (Department of Medical Oncology, The Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou Guangdong 510260, China)

CHEN Jing-qi E-mail: chenjingqi2002@163.com

Background and purpose：In the microenvironment of breast cancer, tumor associated macrophages (TAMs) secrete CCL18, and CCL18 has negative correlation with prognosis of patients. The present study investigated whether CCL18 derived from TAMs, promoted breast cancer cells adherence on extracellular matrix (ECM), and further interpreted the molecular mechanism of CCL18 promoting breast cancer adherence. Methods：In the serum-free culture system of breast cancer cells, in cultivation plate coated with fibronectin, adherence assay was performed to detect CCL18 function on breast cancer SK-3rdcells to adherence on ECM, and immunofluorescence was carried out to detect CCL18 influence integrin aggregation on SK-3rd. Results：CCL18 elevated the number of SK-3rdbreast cancer cells to adherence on ECM, via integrin α5β1 aggregation. Conclusion：CCL18 promotes breast cancer cells adherence on ECM via integrin aggregation.

Breast cancer; CCL18; Adherence; Extracellular matrix; Integrin

R737.9

：A

：1007-3639(2013)01-0026-06

2012-11-05

2013-01-09）

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No：81172537)；廣州市屬高?？萍加?jì)劃項(xiàng)目(No：08A080)。

陳靜琦 E-mail:chenjingqi2002@163.com

DOI: 10.3969/j.issn.1007-3969.2013.01.004