徐寒子貢震吳王飛葉勁軍陸諤梅孫志華韓從輝

1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，江蘇省腫瘤醫(yī)院放療科，江蘇 南京 210009；

2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京婦幼保健院婦幼醫(yī)學(xué)研究中心，江蘇 南京 210011；

3.東南大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009

單抗靶向超抗原SEA體內(nèi)抗膀胱腫瘤實(shí)驗(yàn)研究

徐寒子1貢震2,3吳王飛2葉勁軍1陸諤梅1孫志華1韓從輝3

1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，江蘇省腫瘤醫(yī)院放療科，江蘇 南京 210009；

2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京婦幼保健院婦幼醫(yī)學(xué)研究中心，江蘇 南京 210011；

3.東南大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009

背景與目的：超抗原葡萄球菌腸毒素A(staphylococcal enterotoxin A，SEA)在體內(nèi)、外以及臨床的膀胱灌注治療試驗(yàn)中對(duì)膀胱癌均具有明顯的抑瘤效應(yīng)，本研究旨在探討單抗靶向的超抗原SEA體內(nèi)對(duì)人膀胱癌的抑瘤作用。方法：以腹腔注射人外周血單個(gè)核細(xì)胞、皮下注射人膀胱癌BIU87細(xì)胞建立人免疫重建荷人膀胱癌SCID小鼠復(fù)合模型，再將模型小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、SEA組及單抗靶向SEA實(shí)驗(yàn)組，分別予以PBS、SEA及單抗靶向SEA瘤周注射，以SonoSite彩超在建模后6周內(nèi)檢測(cè)小鼠皮下移植瘤體積、瘤體血流。結(jié)果：?jiǎn)慰拱邢騍EA組瘤體體積、瘤體血流均小于對(duì)照組及SEA組，在建模后4、5、6周差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論：?jiǎn)慰拱邢虻某乖璖EA對(duì)膀胱癌皮下移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用更強(qiáng)，可能與其進(jìn)一步減少瘤體血流有關(guān)。

膀胱腫瘤；超抗原；葡萄球菌類(lèi)毒素；抗體，單克??；免疫治療

超抗原葡萄球菌腸毒素A(staphylococcal enterotoxin A，SEA)是一種強(qiáng)大的T細(xì)胞激活劑［1］，激活的T細(xì)胞克隆數(shù)達(dá)普通抗原的數(shù)千乃至數(shù)萬(wàn)倍。在以往的研究中其已被證實(shí)可有效激活T淋巴細(xì)胞，進(jìn)而對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)大的殺傷作用［2］，但是這種殺傷作用存在抗瘤譜窄、特異性差等缺陷。

Forsberg等［3］的研究已證實(shí)，以抗腫瘤單克隆抗體與超抗原的偶聯(lián)物或者它們的融合蛋白所制備的單抗靶向超抗原，其抗腫瘤模型在多種實(shí)體腫瘤中可有效克服上述缺點(diǎn)。目前，該方面的研究鮮見(jiàn)有膀胱癌領(lǐng)域的結(jié)果報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)以化學(xué)方法成功制備抗人膀胱癌單克隆抗體BDI-1Fab靶向的超抗原SEA［4］，在體外充分驗(yàn)證其對(duì)膀胱癌細(xì)胞殺傷效應(yīng)的基礎(chǔ)上［5］，觀察單抗靶向的超抗原SEA在體內(nèi)對(duì)人膀胱腫瘤的抑瘤效應(yīng)及可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 試劑

RPMI-1640為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司，人淋巴細(xì)胞分離液系挪威Axis-Shield PoC AS公司產(chǎn)品，單抗靶向SEA按文獻(xiàn)［4］方法，由本室采用異型雙功能連接劑N-琥珀酰亞氨基-3-(2-二硫吡啶)丙酸酯偶聯(lián)超抗原SEA與抗人膀胱癌單克隆抗體BDI-1 Fab段自制而成。

1.2 細(xì)胞

人膀胱癌移行細(xì)胞株BIU-87購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)昆明細(xì)胞庫(kù)，以含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)；健康成人新鮮外周血以淋巴細(xì)胞分離液梯度離心后取外周血淋巴細(xì)胞(human peripheral blood lymphocyte，PBL)備用。

1.3 動(dòng)物模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組

參照文獻(xiàn)［6-7］方法，SCID小鼠于建模前1天接受3.5 Gy全身照射，而后于鼠后肢內(nèi)側(cè)皮下接種3×106個(gè)BIU-87細(xì)胞、腹腔注射5×107個(gè)PBL細(xì)胞建立人免疫重建荷人膀胱癌SCID小鼠復(fù)合模型；并按隨機(jī)區(qū)組法隨機(jī)將其分為空白對(duì)照組、SEA組及單抗靶向超抗原SEA組(單抗靶向SEA組)3組，每組6只。

1.4 荷瘤小鼠的處理

單抗靶向SEA組小鼠于建模后的2～3周內(nèi)每隔2 d予以總量20 μg的單抗靶向SEA瘤周注射，SEA組則以等摩爾濃度的SEA瘤周注射，而空白對(duì)照組僅給予PBS瘤周注射。以索諾聲便攜彩超(美國(guó)SonoSite公司產(chǎn)品)檢測(cè)皮下移植瘤的生長(zhǎng)與瘤體血流情況，測(cè)量瘤體所得最長(zhǎng)徑D和最短徑d，按公式Dd2/2計(jì)算腫瘤近似體積，繪制移植瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)；建模后6周處死小鼠剝瘤鏡檢。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，均值以x±s 表示，計(jì)量資料兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 移植瘤生長(zhǎng)

建立動(dòng)物模型后的2～3周內(nèi)，單抗靶向SEA組小鼠移植瘤的生長(zhǎng)明顯受抑，與空白對(duì)照組在建模后的3、4、5、6周差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖1、2)，而與SEA組則在建模后4、5、6周差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖1、2)。

圖 1 處死小鼠前皮下移植瘤典型超聲檢查及大體結(jié)果Fig. 1 The representative images of ultrasound imaging and harvested tumors for xenografts

圖 2 小鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig. 2 The growth curve of xenograft after quantification

2.2 瘤體血流

以術(shù)中探頭檢測(cè)小鼠移植瘤，經(jīng)SonoSite彩超成像可以直觀的觀察到，單抗靶向SEA組的瘤體動(dòng)、靜脈血流較空白對(duì)照組及SEA組明顯減少；而血流Doppler結(jié)果也顯示，單抗靶向SEA組的瘤體動(dòng)、靜脈血流較空白對(duì)照組及SEA組明顯減少，提示移植瘤生長(zhǎng)受抑，可能與其血流減少有關(guān)(圖3)。

圖 3 處死小鼠前移植瘤典型超聲彩色Doppler成像Fig. 3 The representative images of ultrasound Doppler imaging for xenografts before sacrifice

3 討 論

膀胱癌是我國(guó)常見(jiàn)泌尿系惡性腫瘤，其中有70%～80%是以復(fù)發(fā)和進(jìn)展為特征的非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer，NMIBC)。標(biāo)準(zhǔn)的治療方案是經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除輔以膀胱灌注化療或免疫治療(如卡介苗等)。即便如此，復(fù)發(fā)與進(jìn)展仍然很難控制；并且此類(lèi)輔助治療本身還會(huì)誘發(fā)局部或系統(tǒng)的不良反應(yīng)(如膀胱炎、膀胱出血、感染結(jié)核甚至導(dǎo)致死亡等)。因此，當(dāng)前的膀胱灌注藥物不能滿(mǎn)足臨床的需要［8］。與卡介苗類(lèi)似，超抗原是一種強(qiáng)大的T細(xì)胞激活劑，可同時(shí)與抗原遞呈細(xì)胞的主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)Ⅱ分子和含Vβ片段的T淋巴細(xì)胞受體結(jié)合，使含Vβ片段的T細(xì)胞大量增殖并釋放大量的細(xì)胞因子，從而對(duì)多種腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)大的殺傷作用［9］。

SE是當(dāng)前研究最廣泛的一種超抗原，已有的研究結(jié)果顯示：SE無(wú)論是在體外、體內(nèi)，還是膀胱灌注治療試驗(yàn)中，均可對(duì)膀胱腫瘤具有強(qiáng)大的殺傷作用［2,10-11］。但是，僅有很少一部分膀胱腫瘤細(xì)胞表達(dá)MHCⅡ分子；與此同時(shí)，由SEA活化的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞及其所釋放的細(xì)胞因子同樣也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成嚴(yán)重的不良反應(yīng)，臨床單一應(yīng)用超抗原灌注治療膀胱癌仍存在較大限制。鑒于本研究前期的體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)單抗靶向的超抗原SEA可顯著增強(qiáng)對(duì)MHCⅡ分子陰性膀胱腫瘤細(xì)胞的增殖抑制活性［5］，本研究旨在驗(yàn)證其在體內(nèi)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。

考慮所用單抗靶向超抗原SEA的抗膀胱癌單克隆抗體BDI-1系鼠抗人單抗，同時(shí)實(shí)驗(yàn)的目的又旨在探討超抗原SEA激活淋巴細(xì)胞對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，因此本實(shí)驗(yàn)選擇了人免疫重建荷人膀胱癌SCID小鼠作為模型動(dòng)物。在給藥方式上，基于膀胱灌注治療可顯著降低膀胱癌保留膀胱術(shù)后的復(fù)發(fā)率［12］，因而本實(shí)驗(yàn)最終設(shè)想將制備的單抗靶向超抗原SEA應(yīng)用于膀胱灌注而非全身靜脈給藥，并選擇了瘤周注射這一更有助于模擬膀胱灌注的給藥方式。對(duì)于皮下移植瘤生長(zhǎng)的監(jiān)測(cè)，基于前期的研究結(jié)果［4-5］，考慮到：①即便是復(fù)合模型的空白對(duì)照組，其移植瘤體積也顯著小于常見(jiàn)皮下移植瘤；②不同于裸鼠，SCID小鼠存在毛發(fā)，因此以常規(guī)的游標(biāo)卡尺測(cè)量瘤徑大小可能存在較大系統(tǒng)誤差，而高頻術(shù)中超聲探頭的應(yīng)用即可較好地解決上述問(wèn)題［13］：較之腹部凸陣探頭，術(shù)中探頭掃描頻率高、組織穿透力低、影像分辨率高，因而可以高分辨地探測(cè)皮下2～3 mm的移植瘤，因此本實(shí)驗(yàn)采用SonoSite彩超進(jìn)行皮下移植瘤生長(zhǎng)的監(jiān)測(cè)。

最新研究結(jié)果顯示，超抗原的抑瘤效應(yīng)可能部分是通過(guò)抗血管生成來(lái)實(shí)現(xiàn)的［14］。為了解單抗靶向SEA抗膀胱癌的可能機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)又以彩色超聲Doppler對(duì)瘤區(qū)的血流進(jìn)行了檢測(cè)分析，結(jié)果與Reis等［14］的研究類(lèi)似。提示單抗靶向的超抗原SEA所具有的膀胱癌抑瘤效應(yīng)，可能與其進(jìn)一步減少瘤區(qū)的血供有關(guān)。當(dāng)然，相關(guān)的分子機(jī)制有待進(jìn)一步的深入研究。

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The anti-tumor effect of monoclonal antibody targeted superantigen SEA on human bladder cancer in vivo

XU Han-zi1, GONG Zhen2,3, WU Wang-fei2, YE Jin-jun1, LU E-mei1, SUN Zhi-hua1, HAN Cong-hui3(1. Department of Radiation oncology, Jiangsu Cancer Hospital Affiliated to Nanjing Medical University, Nanjing Jiangsu 210000, China; 2. Medicine Research Center, Nanjing Maternity and Child Health Care Hospital Affiliated to Nanjing Medical University, Nanjing Jiangsu 210000, China; 3.School of Clinical Medicine, Southeast University, Nanjing Jiangsu 210009, China)

XU Han-zi E-mail: benben_cat@126.com

Background and purpose：Staphylococcal enterotoxin A (SEA) is potent T-cell stimulators which will produce significant tumor inhibition on bladder cancer. This study was to investigate the anti-tumor effect of monoclonal antibody targeted superantigen SEA on human bladder cancer in vivo. Methods：Hu-PBL-SCID mice of human bladder carcinoma, which were transplanted with human peripheral blood lymphocyte intraperitoneally and injected with human bladder carcinoma cells BIU87 subcutaneously, were divided randomly into 3 groups: control, SEA and monoclonal antibody targeted SEA group, subject to subcutaneous injection with PBS, SEA, or monoclonal antibody targeted SEA surrounding the xenograft respectively. Tumor size and blood flow were monitored under the SonoSite ultrasound system. Results：Compared with control and SEA groups, the tumor size and blood flow of monoclonal antibody targeted SEA group were significantly depressed (P＜0.05). Conclusion：Monoclonal antibody targeted SEA significantly depresses the xenograft growth, possibly through the down-regulation of tumor blood flow.

Superantigens; Staphylococcal enterotoxin A; Antibodies; monoclonal; bladder carcinoma; Immunotherapy

R737.14

：A

：1007-3639(2013)01-0032-04

2012-08-23

2012-12-10）

國(guó)家自然科學(xué)基金(No：81202007)。

徐寒子 E-mail:benben_cat@126.com

DOI: 10.3969/j.issn.1007-3969.2013.01.005