樊全榮史俊文賈俊雙高飛張余琴趙尊蘭姚開泰肖東,2

1.南方醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所，廣東 廣州 510515；

2.南方醫(yī)科大學(xué)比較醫(yī)學(xué)研究所暨實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣東 廣州 510515

攜帶Fluc和ZsGreen雙報(bào)告基因小鼠iPS細(xì)胞系的建立

樊全榮1史俊文1賈俊雙1高飛1張余琴1趙尊蘭1姚開泰1肖東1,2

1.南方醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所，廣東 廣州 510515；

2.南方醫(yī)科大學(xué)比較醫(yī)學(xué)研究所暨實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣東 廣州 510515

背景與目的：誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPS細(xì)胞)在修復(fù)受損組織器官和治療人類疾病方面已展示了良好的應(yīng)用前景，但iPS細(xì)胞具有形成畸胎瘤的作用，這是其安全應(yīng)用于臨床的巨大障礙之一。為此本研究擬利用慢病毒體外感染的方法，建立攜帶螢火蟲熒光素酶(firefly luciferase，F(xiàn)luc)和綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，ZsGreen)雙報(bào)告基因的小鼠iPS細(xì)胞系，為活體動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)畸胎瘤形成、定植和形成畸胎瘤所需最小細(xì)胞劑量等提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法：構(gòu)建含F(xiàn)luc和ZsGreen雙報(bào)告基因的慢病毒載體。以pLH2BmRFP質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增獲得Fluc基因片段，將其克隆至利用BamHⅠ酶切的pHAGE-fullEF1a-MCS-IZsGreen質(zhì)粒中，挑選一個(gè)陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，最終獲得攜帶雙報(bào)告基因的慢病毒載體pEF1a-Fluc-IRES-ZsGreen(pELZG)。采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染生產(chǎn)攜帶Fluc和ZsGreen基因的病毒，收集病毒上清，并感染iPS細(xì)胞，數(shù)天后熒光顯微鏡下觀察是否有綠色熒光的iPS細(xì)胞克隆，不斷挑取ZsGreen陽(yáng)性的iPS細(xì)胞克隆以進(jìn)一步純化。將標(biāo)記好的iPS細(xì)胞移植入裸鼠皮下，觀察成瘤情況。結(jié)果：pELZG載體分別經(jīng)XbaⅠ、PvuⅡ、SacⅠ單酶切，得到的片段大小分別為10.005、3.282和6.723 kb，2.441、3.401和6.604 kb，預(yù)示成功構(gòu)建了Fluc和ZsGreen雙報(bào)告基因的慢病毒載體。利用其生產(chǎn)的病毒上清成功感染iPS細(xì)胞，經(jīng)過(guò)不斷的純化，最終獲得含穩(wěn)定表達(dá)Fluc和ZsGreen雙報(bào)告基因的小鼠iPS細(xì)胞系。將標(biāo)記好的iPS細(xì)胞植入裸鼠皮下后，觀察到畸胎瘤的形成。結(jié)論：成功建立了攜帶Fluc和ZsGreen雙報(bào)告基因的小鼠iPS細(xì)胞系，為相關(guān)后續(xù)研究打下了良好的基礎(chǔ)。標(biāo)記后的iPS細(xì)胞對(duì)畸胎瘤的形成和發(fā)展具有很好的示蹤作用。

螢火蟲熒光素酶；綠色熒光蛋白；慢病毒；293T細(xì)胞；誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞；畸胎瘤

自日本和美國(guó)研究小組先后用4種基因?qū)⑿∈蠛腿说捏w細(xì)胞在體外重編程為誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPS細(xì)胞)以來(lái)，iPS細(xì)胞的研究和關(guān)注度呈爆炸式增長(zhǎng)［1-3］。iPS細(xì)胞類似于ES細(xì)胞，有很強(qiáng)的自我更新和分化能力，使其具有分化成各種組織和器官的潛能，并且目前已成功建立了個(gè)體、疾病或患者特異的人iPS細(xì)胞系［4］。此類iPS細(xì)胞應(yīng)用于臨床，不存在免疫排斥和倫理道德問(wèn)題。因此，iPS細(xì)胞具有十分重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。但是，iPS細(xì)胞自身存在很多不安全因素，要真正應(yīng)用于臨床還有很多問(wèn)題亟待解決。其中之一就是iPS細(xì)胞在體內(nèi)易形成畸胎瘤。如何簡(jiǎn)單直觀靈敏地檢測(cè)iPS細(xì)胞形成畸胎瘤的細(xì)胞劑量，動(dòng)態(tài)活體可視化觀察畸胎瘤形成、定植和轉(zhuǎn)歸是目前該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一，而小動(dòng)物活體成像技術(shù)在該研究領(lǐng)域大有用武之地［5］。小動(dòng)物活體成像技術(shù)主要分為光學(xué)成像、核素成像、磁共振成像、超聲成像和CT成像5大類，其中光學(xué)成像主要采用生物發(fā)光和熒光兩種技術(shù)。生物發(fā)光成像是用螢火蟲熒光素酶(firefly luciferase，F(xiàn)luc)基因標(biāo)記細(xì)胞，而熒光成像技術(shù)則采用熒光報(bào)告基團(tuán)GFP、ZsGreen和RFP等進(jìn)行標(biāo)記；生物發(fā)光成像靈敏度高、特異性極強(qiáng)、可精確定量、組織穿透力強(qiáng)，而熒光成像雖有背景噪音、靈敏度低和組織穿透力弱等缺點(diǎn)，但熒光信號(hào)強(qiáng)、標(biāo)記靶點(diǎn)多樣、觀察直觀、檢測(cè)方便。因此，對(duì)于不同研究，應(yīng)根據(jù)生物發(fā)光成像和熒光成像各自特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)進(jìn)行選擇。為綜合生物發(fā)光和熒光成像的優(yōu)點(diǎn)，本研究擬借助慢病毒［6-7］將Fluc和ZsGreen雙報(bào)告基因?qū)胄∈骾PS細(xì)胞的基因組內(nèi)，以獲得Fluc和ZsGreen基因標(biāo)記的小鼠iPS細(xì)胞系，為后續(xù)iPS細(xì)胞畸胎瘤形成研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 載體

慢病毒載體pHAGE-fullEF1a-MCS-IzsGreen由美國(guó)哈弗醫(yī)學(xué)院的Jeng-Shin Lee博士惠贈(zèng)；pLH2BmRFP由本課題組構(gòu)建(內(nèi)含F(xiàn)luc基因序列)；慢病毒包裝系統(tǒng)psPAX2和pMD2.G由瑞士Didier Trono博士惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶、感受態(tài)、膠回收試劑盒和連接試劑盒均購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司，脂質(zhì)體LipofectamineTM2000、Opti-MEM?Ⅰ Medium、高糖DMEM、澳洲胎牛、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、2-Mercaptoethanol、Sodium Pyruvate、LIF、胰蛋白酶和DMSO等購(gòu)自Invitrogen公司，培養(yǎng)板及培養(yǎng)瓶等購(gòu)自Corning公司。

1.1.3 細(xì)胞

293T細(xì)胞購(gòu)自Invitrogen公司，飼養(yǎng)層細(xì)胞由本課題組原代培養(yǎng)得到，小鼠iPS細(xì)胞購(gòu)自SBI公司。

1.1.4 動(dòng)物

4～5周齡裸鼠購(gòu)自廣州省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，ICR鼠購(gòu)自廣州賽業(yè)生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建攜帶Fluc和ZsGreen雙報(bào)告基因的慢病毒載體

⑴引物設(shè)計(jì)和合成：利用Pubmed Primer blast軟件，根據(jù)已知的Fluc序列設(shè)計(jì)引物(表1)。將設(shè)計(jì)好的引物送至大連寶生物工程有限公司合成。

⑵目的片段的擴(kuò)增：使用 PrimeSTAR?HS DNA Polymerase (Code No.DR010S)擴(kuò)增。反應(yīng)體系：pLH2BmRFP 1 μL，5×PrimeSTAR Buffer (Mg2+plus) 10 μL，dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)4 μL，F(xiàn)luc-F (5 pmol/μL) 0.5 μL，F(xiàn)luc-R(5 pmol/μL) 0.5 μL，PrimeSTAR HS DNA聚合酶(2.5 U/μL) 0.5 μL，再加ddH2O至50 μL。反應(yīng)條件：98 ℃變性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)。然后72 ℃延伸5 min。使用 TaKaRa Agarose Gel DNA純化試劑盒Ver.2.0(CodeNo.DV805A)切膠回收目的片段Fluc。取 1 μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。

表 1 Fluc序列設(shè)計(jì)引物Tab. 1 Primers for Fluc reporter gene amplified by PCR

⑶重組質(zhì)粒的構(gòu)建：將質(zhì)粒pHAGE-fullEF1a-MCS-IzsGreen用BamH Ⅰ酶切。反應(yīng)體系：pHAGE-fullEF1a-MCS-IZsGreen 10 μL，10×Buffer 5 μL，BamH Ⅰ(10 U/μL)1.5 μL，再加ddH2O至50 μL。在37 ℃進(jìn)行酶切4 h。使用TaKaRa Agarose Gel DNA純化試劑盒Ver.2.0(Code No.DV805A)切膠回收載體片段，得到連接用載體片段。使用In-Fusion?HD克隆試劑盒(Clontech Code No.639633)，將目的片段Fluc和連接用載體片段連接。連接體系：目的片段Fluc (約50 ng/μL)1 μL，連接用載體片段(約80 ng/μL)1 μL，5×In-Fusion HD Enzyme Premix 2 μL，加ddH2O至10 μL。連接條件：50 ℃，15 min。將連接產(chǎn)物取1 μL熱轉(zhuǎn)化至E. Coli Competent Cell JM109 (Code No. D9052)中，涂布平板，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取陽(yáng)性克隆，酶切及測(cè)序鑒定后，得到pEF1a-Fluc-IRESZsGreen(pELZG)質(zhì)粒。

1.2.2 制備攜帶Fluc和ZsGreen雙報(bào)告基因的慢病毒

復(fù)蘇293T細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染前1天將其傳到25 cm2的培養(yǎng)瓶中，密度保證第2天達(dá)90%。轉(zhuǎn)染時(shí)，將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基換成170 μL的Opti-MEM，先把LipofectamineTM2000 17 μL加到500 μL Opti-MEM中，為B液，靜置5 min；同時(shí)將慢病毒載體pELZG和包裝質(zhì)粒psPAX2及pMD2.G按一定比例加到另一管500 μL Opti-MEM中，為A液。接著將A液加到B液中，將其充分混勻，室溫放置20 min，然后把A液和B液混合物加到培養(yǎng)瓶中。轉(zhuǎn)染6～8 h更換成新鮮的培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48～72 h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞發(fā)光情況，并適時(shí)拍照。確認(rèn)轉(zhuǎn)染成功后，收集含病毒的細(xì)胞培養(yǎng)液，3 000×g離心15 min去除細(xì)胞碎片，取上清液，分裝，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩Ｓ檬占牟《旧锨逡焊腥?93T細(xì)胞，檢測(cè)病毒是否成功生產(chǎn)。

1.2.3 慢病毒感染iPS細(xì)胞

選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的iPS細(xì)胞，胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，利用差速貼壁法分離iPS細(xì)胞和飼養(yǎng)層細(xì)胞。對(duì)分離后iPS細(xì)胞計(jì)數(shù)，以每孔1×105個(gè)的密度接種到無(wú)飼養(yǎng)層細(xì)胞的24孔板中。第2天待細(xì)胞貼壁后加入含病毒上清液和轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑polybrene (2 μg/mL)的完全培養(yǎng)基。放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6～8 h后換成新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，第2天將細(xì)胞用胰酶消化，重新鋪到事先準(zhǔn)備好的飼養(yǎng)層細(xì)胞上。感染后48～72 h，利用倒置熒光顯微鏡和小動(dòng)物活體成像儀分別檢測(cè)ZsGreen和Fluc基因表達(dá)。

1.2.4 裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)

選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的攜帶ZsGreen和Fluc基因的iPS細(xì)胞，用胰酶消化將其吹打成單細(xì)胞懸液，利用差速貼壁法將iPS細(xì)胞和飼養(yǎng)層分開，對(duì)分離后的iPS細(xì)胞計(jì)數(shù)。取1只4～5周齡的裸鼠，將分離后的iPS細(xì)胞注射進(jìn)裸鼠皮下，選取部位和注射劑量分別為：左上胸部，1×106個(gè)/100 μL；右下腹部，5×105個(gè)/100 μL。密切觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，1個(gè)月后取材。取材前，利用小動(dòng)物活體成像儀檢測(cè)腫瘤Fluc基因的表達(dá)情況；將腫瘤取出后，在體視熒光顯微鏡下觀察是否見綠色熒光。

1.2.5 腫瘤組織切片HE染色

將部分腫瘤組織放入4%多聚甲醛溶液固定2～3 d后取出，沖水2 h，接著放入自動(dòng)脫水機(jī)內(nèi)脫水，然后進(jìn)行包埋。將制備好的蠟塊用組織切片機(jī)切片，切片放入65 ℃烤箱中烘烤2 h，最后將切片放入自動(dòng)染色機(jī)內(nèi)染色。染色完畢后，在顯微鏡下觀察。

2 結(jié) 果

2.1 攜帶Fluc和ZsGreen雙報(bào)告基因慢病毒載體的構(gòu)建

在泛表達(dá)啟動(dòng)子EF1a的下游和報(bào)告基因ZsGreen之間插入Fluc基因片段，獲得攜帶雙報(bào)告基因的慢病毒載體pEF1a-Fluc-IRESZsGreen，命名為pELZG，其載體結(jié)構(gòu)圖(圖1A)。以質(zhì)粒pLH2BmRFP為模板，以Fluc-F/ Fluc-R特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖1B)，由電泳圖可以看出該引物擴(kuò)增出單一的條帶，片段大小為1 650 bp。對(duì)該片段大小進(jìn)行膠回收和純化，得到Fluc基因DNA。質(zhì)粒pELZG酶切鑒定結(jié)果(圖1C)。質(zhì)粒pHAGE-fullEF1a-MCS-IzsGreen經(jīng)BamHⅠ單酶切(圖1C-1)，得到連接用載體(8.346 kb)；pELZG載體分別經(jīng)XbaⅠ、PvuⅡ、SacⅠ單酶切(圖1C-3、4、5)、得到的片段大小分別為10.005、3.282和6.723 kb，2.441、3.401和6.604 kb。以上結(jié)果均與預(yù)期結(jié)果相符。

2.2 慢病毒包裝

慢病毒載體pELZG與病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，24 h后倒置熒光顯微鏡下可見綠色熒光(圖2A)，證明轉(zhuǎn)染成功。同時(shí)，用收集到的病毒上清液感染293T細(xì)胞，24 h后可見綠色熒光(圖2B)，證明病毒生產(chǎn)成功。

2.3 慢病毒成功感染iPS細(xì)胞

按“材料和方法”部分介紹的方法用攜帶Fluc和ZsGreen基因的病毒上清液感染iPS細(xì)胞。開始時(shí)得到摻雜ZsGreen陰性的iPS細(xì)胞克隆，經(jīng)過(guò)多次挑取陽(yáng)性克隆后，得到100%的ZsGreen陽(yáng)性的細(xì)胞克隆，然后用小動(dòng)物活體成像儀檢測(cè)iPS細(xì)胞Fluc的表達(dá)，成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)Fluc和ZsGreen雙報(bào)告基因的iPS細(xì)胞系(圖3)。

圖 1 pELZG載體構(gòu)建與鑒定Fig. 1 The construction and identification of pELZG vector

圖 2 制備攜帶Fluc和ZsGreen基因的慢病毒Fig. 2 Preparation and identification of lentiviral carrying the Fluc and ZsGreen genes

圖 3 攜帶Fluc和ZsGreen基因的慢病毒感染iPS細(xì)胞Fig. 3 The lentivirus carrying Fluc and ZsGreen genes infected iPS cells

2.4 經(jīng)Fluc和ZsGreen基因遺傳修飾的iPS細(xì)胞體內(nèi)分化潛能

基于裸鼠皮下畸胎瘤形成實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，經(jīng)Fluc和ZsGreen基因遺傳修飾的iPS細(xì)胞是否仍具有多向分化潛能。攜帶Fluc和ZsGreen基因的iPS細(xì)胞接種到裸鼠皮下1周左右，開始出現(xiàn)腫瘤塊；4周時(shí)瘤塊約為1.2～10 cm3(圖4A)。 取材前，小動(dòng)物活體成像儀檢測(cè)到腫瘤組織中Fluc基因表達(dá)(圖4B)；取出后的瘤塊組織置于體視熒光顯微鏡下，可見綠色熒光(圖4C)。

瘤塊組織的石蠟塊經(jīng)切片做HE染色，顯微鏡下觀察可見3個(gè)胚層來(lái)源的組織，如上皮樣結(jié)構(gòu)(圖4D-a)、肺泡(圖4D-b)和脂肪(圖4D-c)等，這些符合畸胎瘤的分化特點(diǎn)?？梢娊?jīng)Fluc和ZsGreen基因遺傳修飾的iPS細(xì)胞具有形成畸胎瘤的作用，即攜帶Fluc和ZsGreen基因的小鼠，iPS細(xì)胞仍然保留多向分化潛能。

圖 4 裸鼠畸胎瘤熒光檢測(cè)及HE染色Fig. 4 The fluorescence detection and HE staining of the teratoma formed in nude mice.

3 討 論

通常，如借助慢病毒將外源基因?qū)肱咛ジ杉?xì)胞或iPS細(xì)胞，需用濃縮后的病毒感染這些細(xì)胞，這就需大量生產(chǎn)慢病毒，接著收集病毒上清，并經(jīng)超速離心機(jī)濃縮，該方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、費(fèi)錢［8］；本實(shí)驗(yàn)利用病毒上清液直接感染iPS細(xì)胞，取得了理想的感染效果，避免了繁瑣的病毒濃縮，不僅省時(shí)、省力，而且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。

iPS 細(xì)胞的分化潛能使其可以在體內(nèi)和體外分化成各種功能細(xì)胞，而利用iPS細(xì)胞和其分化得到的功能細(xì)胞對(duì)損傷的組織進(jìn)行修復(fù)，即所謂的iPS細(xì)胞替代治療［9-12］。iPS細(xì)胞移植在臨床上治療某些組織器官死亡或功能衰竭具有很大的潛力，iPS細(xì)胞雖然避免了免疫排斥的風(fēng)險(xiǎn)，但是還存在很多不安全因素，比如在受者體內(nèi)容易形成畸胎瘤?；チ龅漠a(chǎn)生不僅不能完成移植的既定目標(biāo)，還對(duì)機(jī)體造成了更大的損傷。iPS細(xì)胞及其衍生而來(lái)的細(xì)胞移植形成的畸胎瘤是在移植部位發(fā)生的，原因是移植過(guò)程中將未分化或低分化的iPS細(xì)胞引入體內(nèi)。所以，為避免畸胎瘤發(fā)生，重點(diǎn)要把握好植入機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞分化能力，以及要將移植細(xì)胞中所含未分化或低分化的iPS細(xì)胞的數(shù)量控制在不能形成畸胎瘤的范圍內(nèi)。利用慢病毒體外感染的方法，建立穩(wěn)定表達(dá)Fluc和ZsGreen雙報(bào)告基因的iPS細(xì)胞系，有助于我們?cè)诤罄m(xù)研究中利用小動(dòng)物活體成像技術(shù)明確iPS細(xì)胞成瘤的最小劑量，對(duì)于長(zhǎng)期動(dòng)態(tài)觀察iPS細(xì)胞在體內(nèi)的分布具有重要意義。

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《中國(guó)醫(yī)藥科學(xué)》雜志征訂啟事

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Generation of an induced pluripotent stem cell line harboring Fluc and ZsGreen dual reporter genes

FAN Quan-rong1, SHI Jun-wen1, JIA Jun-shuang1, GAO Fei1, ZHANG Yu-qin1, ZHAO Zun-lan1, YAO Kaitai1, XIAO Dong1,2(1. Cancer Research Institute, Southern Medical University, Guangzhou Guangdong 510515, China; 2. Institue of Comparative Medicine and Center of Experimental Animals, Southern Medical University, Guangzhou Guangdong 510515, China)

XIAO Dong E-mail: Xiao_d@hotmail.com

Background and purpose：Induced pluripotent stem cells (iPS cells) have demonstrated a good prospect, which includes repairing damaged tissues, organs and the treatment of human diseases, but iPS cells have the ability to form a teratoma, which is one of the huge obstacles involved in its security used in clinical trials. Thus, this study intended to establish mouse iPS cell lines carrying firefly luciferase (Fluc) and green fluorescent protein (ZsGreen) dual reporter genes to lay the foundation for in vivo monitoring teratoma formation and determining the minimum cell dose required for teratoma formation. Methods：To generate lentiviral expression vector harboring Fluc and zsGreen genes, Fluc gene was amplified by PCR from the template of pLH2BmRFP, and subsequently cloned into the plasmid of pHAGE-fullEF1a-MCS-IzsGreen to obtain the final vector of pEF1a-Fluc-IRES-ZsGreen (referred to as pELZG) which was used to produce lentiviruses carrying Fluc and ZsGreen genes, followed by confirming that lentiviruses harboringFluc and ZsGreen genes were successfully made through GFP assay under fluorescent stereo microscope after infecting 293T cells. Lentivirus supernatant harboring Fluc and ZsGreen genes were employed to infect iPS cells, followed by GFP assay under fluorescent stereo microscope several days after infection. The labeled iPS cells were transplanted into subcutaneous of nude mice. Results：As expected, the gel electrophoresis of pELZG vector respectively digested with XbaⅠ, PvuⅡ and SacⅠ, respectively resulted in a 10.005 kb, 3.282 kb, 6.723 kb, and 2.441 kb, 3.401 kb, 6.604 kb bands. It indicated that the lentiviral vector carrying the Fluc and ZsGreen dual reporter gene was successfully constructed. Mouse iPS cells were successfully infected by lentivirus supernatant, while the complete GFP-positive iPS cell colonies were obtained by picking clones. After iPS cells were transplanted into nude mice, teratoma formation was observed. Conclusion：Mouse iPS cell line stably expressing Fluc and ZsGreen genes was successfully generated, and the Fluc- and ZsGreen-labeled iPS cells can trace the formation and development of the teratoma.

Firefly luciferase; Green fluorescent protein; Lentivirus; 293T cells: Induced pluripotent stem cells; Teratoma

R730.269

：A

：1007-3639(2013)01-0010-07

2012-09-21

2012-11-02）

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No：81172587)；廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No：9151063101000015)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(No：2009B060300008)。

肖東 E-mail:Xiao_d@hotmail.com

DOI: 10.3969/j.issn.1007-3969.2013.01.002