李彩景

福建省立醫(yī)院藥學(xué)部，福建 福州 350001

加拿大一枝黃花總黃酮最佳提取工藝的研究

李彩景

福建省立醫(yī)院藥學(xué)部，福建 福州 350001

目的：提取一枝黃花中總黃酮并測定含量，確定最佳提取工藝。方法：采用乙醇回流提取總黃酮，比色法測定總黃酮的含量，高效液相測定總黃酮中蘆丁含量，冷浸法測定總黃酮浸出物含量。結(jié)果：用70%的8倍于加拿大一枝黃花體積乙醇，提取3次，1.5h／次，提取效果較好。

加拿大一枝黃花；總黃酮；含量測定

加拿大一枝黃花（Solidago Canadensis L）［1］，是原產(chǎn)于北美的一種菊科多年生草本植物，20世紀(jì)30年代開始進(jìn)入我國［2］，現(xiàn)在這種植物已成為我國大部分境內(nèi)迅速擴(kuò)散傳播的惡性雜草。加拿大一枝黃花包含的主要成分有皂苷、揮發(fā)油和黃酮等，其乙醇提取物具有很強(qiáng)的抗氧化和自由基消除能力，在諸多類型天然抗氧化劑中［3］，黃酮類成分能有效減輕細(xì)胞的過氧化脅迫，阻止低密度脂質(zhì)的過氧化等作用。為了綜合利用加拿大一枝黃花，變廢為寶［4］，用植物類黃酮的獨特優(yōu)勢，確定加拿大一枝黃花總黃酮的最佳提取工藝，為后續(xù)開辟安全、無副作用的綠色化妝品提供便利［5］。

1 加拿大一枝黃花提取工藝研究

1.1 材料來源及處理 加拿大一枝黃花采自南京青龍山，加拿大一枝黃花打粉過40目篩備用［6］。

1.2 正交試驗表頭設(shè)計及總黃酮的提取

表1表頭設(shè)計

表2 正交實驗表

上述試驗藥材加熱回流得到乙醇提取液，揮去乙醇［7］，干燥后得浸膏，稱重（g），如表3。

表3 浸膏質(zhì)量

1.3 紫外法分光光度法（UV）測定樣品中總黃酮含量

1.3.1 儀器與試劑

752紫外可見分光光度計（上海精密科學(xué)儀器有限公司）

蘆丁對照品：中國藥品生物制品鑒定所（100080－200306）

甲醇：色譜純；亞硝酸鈉，硝酸鋁，氫氧化鈉：分析純；蒸餾水。

1.3.2 溶液配制

（1）5%亞硝酸鈉；10%硝酸鋁；1mol／L NAOH溶液。

稱取亞硝酸鈉2.5g置50ml燒杯中，加水配制成5%亞硝酸鈉溶液；

稱取硝酸鋁5g置50ml燒杯中，加水配制成10%硝酸鋁溶液；

稱取NaOH8g置200ml燒杯中，加水配制成1mol／L NAOH溶液。

（2）對照品溶液配制

精密稱取干燥至恒重的蘆丁對照品50mg置100ml容量瓶中，加甲醇適量，置水浴上微熱，使蘆丁溶解，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，得0.5mg／ml對照品溶液。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精密量取對照品溶液（0.5mg／ml）0.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0ml分別置于25ml容量瓶中，各加水至6.0ml，加5%亞硝酸鈉溶液1ml，充分搖勻，放置6min，加入10%硝酸鋁溶液1ml，充分搖勻，放置6mim，加入1mol／L NAOH溶液10ml，再加水至刻度，搖勻，放置15min，于分光光度計上以第一份溶液為空白，在510nm波長［8］，鎢燈，測定吸光度值A(chǔ)，表4，以A為縱坐標(biāo)，對照品溶液濃度C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖1，經(jīng)回歸分析得回歸方程：Y＝11.711X，相關(guān)系數(shù)R2＝0.9991，r ＝0.9995

表4 吸光度值A(chǔ)

1.4 樣品溶液總黃酮含量測定

精密稱取浸膏0.25g，置100ml容量瓶中，加甲醇至刻度，再分別量取5ml置25ml容量瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項的方法，自“各加水至6ml”起依法操作，直至測定出樣品的吸光度值［9］，在根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總黃酮含量，表5。

表5 樣品溶液總黃酮含量測定

1.5 高效液相（HPLC）測定樣品中蘆丁含量

1.5.1 儀器與試劑

Waters2690高效液相色譜儀，996PDA二極管矩陣檢測器，Millennium32色譜管理系統(tǒng)；

蘆丁對照品：中國藥品生物制品鑒定所（100080－200306）；甲醇：色譜純；重蒸餾水：自制。

1.5.2 方法與結(jié)果

色譜條件的選擇和系統(tǒng)適用性試驗：Alltima C18柱（4.6x250nm；5μm），柱溫為300C；以甲醇－0.4%磷酸水（30：70）為流動相，流速為1.0ml／min；檢測波長為360nm。在上述色譜條件下，理論塔板數(shù)按蘆丁計算為6130［10］。

1.5.3 溶液的配置

對照品溶液的制備：精密稱取蘆丁對照品適量，加甲醇制成每1ml含100μg的溶液。

樣品溶液的制備：精密稱取加拿大一枝黃花浸膏0.25g，置100ml容量瓶中，加甲醇至刻度。精密吸取1ml溶液置25ml容量瓶中，加甲醇至刻度。

1.5.4 方法學(xué)考察

（1）外標(biāo)一點法［11］：稱取蘆丁對照品10mg，精密稱定，加甲醇制成對照品貯備液，再精密吸取上述對照品溶液0.8ml，用甲醇定容至5ml，吸取20μl對照品溶液注入液相色譜儀測定，得到其峰面積4129。

（2）樣品含量測定：分別精密吸取樣品溶液20μl注入高效液相色譜儀測定，根據(jù)外標(biāo)一點法計算結(jié)果如表6：

表6 樣品含量

1.6 浸出物量的測定—冷浸法

精密稱取浸膏4g，置100ml錐形瓶中，精密加70%乙醇，密塞，冷浸，前6小時內(nèi)時時振搖，再靜置18小時，用干燥濾器濾過，取20ml濾液［12］。揮去乙醇，干燥精密稱重（g），表7。

表7 浸出物含量

2 結(jié)果與分析

采用SPSS13.0進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計。

2.1 紫外SPSS統(tǒng)計結(jié)果

表8 總黃酮含量正交結(jié)果

2.2 HPLCSPSS統(tǒng)計結(jié)果

表9 蘆丁含量正交結(jié)果

3 正交加權(quán)統(tǒng)計結(jié)果

表10 正交加權(quán)統(tǒng)計結(jié)果

4 結(jié)論

根據(jù)紫外、液相、浸出物結(jié)果的加權(quán)，得出最佳提取工藝：70%的8倍于原藥材體積乙醇，提取3次，1.5h／次。

5 討論

加拿大一枝黃花中含有較為豐富的黃酮類成分［13］，正交試驗中影響提取的效率的四個因素（乙醇濃度，乙醇體積，提取的時間，提取的次數(shù)）中提取的時間和提取的次數(shù)影響較小，而乙醇的濃度影響顯著。所以用7%的8倍于原藥材體積乙醇，提取3次，1.5h／次，提取較完全［14］。

加拿大一枝黃花乙醇提取物具有很強(qiáng)的抗氧化和自由基消除能力，而活性氧與自由基的產(chǎn)生被認(rèn)為與人類的眾多疾病的發(fā)生密切相關(guān)，在諸多類型天然抗氧化劑中［15］，黃酮類成分能有效減輕細(xì)胞的過氧化脅迫，阻止低密度脂質(zhì)的過氧化，預(yù)防和治療多種疾病。通過對加拿大一枝黃花黃酮化合物提取工藝的研究，可以綜合利用加拿大一枝黃花，變廢為寶［16］，同時可以擴(kuò)大藥源，極大的利用資源，具有良好的社會效益［17～18］。

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1007－8517（2013）01－0028－03

2012.10.22）