裴蘭英 （聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院 山東 聊城 252059）

王俊海 （山東省聊城市畜牧站）

田中杰 （河南出入境檢驗(yàn)檢疫局 鄭州）

雞馬立克氏病發(fā)生與細(xì)胞內(nèi)HSP70 mRNA轉(zhuǎn)錄水平相關(guān)性研究

裴蘭英 （聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院 山東 聊城 252059）

王俊海 （山東省聊城市畜牧站）

田中杰 （河南出入境檢驗(yàn)檢疫局 鄭州）

通過人工攻毒建立雞馬立克氏病腫瘤模型。利用熒光定量RT-PCR方法，研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中，HSP70mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化。結(jié)果顯示：攻毒21d后，試驗(yàn)雞肝臟和脾臟內(nèi)HSP70mRNA的轉(zhuǎn)錄水平極顯著升高，而疫苗組和空白組雞肝臟和脾臟內(nèi)HSP70mRNA的轉(zhuǎn)錄水平差異不顯著(P＞0.05)。

馬立克氏病 RT-PCR HSP70mRNA 轉(zhuǎn)錄

惡性腫瘤已成為導(dǎo)致我國城鄉(xiāng)居民因病死亡的一個(gè)重要原因。對腫瘤發(fā)生的機(jī)理和防治措施的研究是近現(xiàn)代醫(yī)學(xué)界科研工作的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。HSP(Heat Shock Protein)是生物圈中最為保守的蛋白分子之一，近年來研究發(fā)現(xiàn)，HSP在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用[1,2,3]。對臨床病例及腫瘤細(xì)胞體的研究表明，發(fā)生腫瘤時(shí)，HSP的表達(dá)量發(fā)生劇烈變化，同時(shí)，有研究表明

HSPs對腫瘤細(xì)胞的生長和存活起重要作用[4]。但有關(guān)腫瘤的發(fā)生發(fā)展與HSPs mRNA轉(zhuǎn)錄、表達(dá)水平之間的動(dòng)態(tài)相關(guān)性未見報(bào)道。本試驗(yàn)通過人工攻毒的方式，建立雞馬立克氏病動(dòng)物模型，定期剖殺試驗(yàn)用雞，采取動(dòng)物組織，利用熒光定量RT-PCR方法，動(dòng)態(tài)研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展與HSP70mRNA轉(zhuǎn)錄水平之間的相關(guān)性，為探索HSPs作為腫瘤發(fā)生的預(yù)警作用提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)為深入研究HSPs在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和試劑

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 200只1日齡SPF來杭雞由聊城某SPF雞場提供。在溫控實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房條件下進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)，試驗(yàn)雞由專人飼養(yǎng)管理。

1.1.2 主要試劑 AMV(D2620)、HS-Taq(DR007A)、Ribonuclease Inhibitor(D2310A)、RNA Marker(D508A)、DNA Marker(D501A)、DNase I(RNase Free，D2215)、Nde I(D1161A)均購自寶生物工程(大連)有限公司；SYBR Green I染料購自上海開放科技有限公司產(chǎn)品；pGEM-T載體系統(tǒng)試劑盒(A3610)、體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)試劑盒(P1440)購自美國Promega公司產(chǎn)品；膠回收(小量)試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司；iCycler iQTM熒光實(shí)時(shí)多波長PCR檢測系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。MD強(qiáng)毒由聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室分離并保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)分組及取樣 將200只1日齡SPF來杭雞分為A、B、C 3組，其中A組為攻毒組，100只試驗(yàn)雞，1日齡攻毒MDV 0.2ml/只；B組為疫苗對照組，50只試驗(yàn)雞，1日齡防疫M(jìn)D疫苗；C組為空白對照組，50只試驗(yàn)雞。各組隔離飼養(yǎng)，分別在21、28、35、42、49日齡分5批進(jìn)行剖殺，采取肝臟和脾臟，液氮保存。

1.2.2 一步法RT-PCR 將組織樣品在液氮存在的條件下進(jìn)行研磨，利用Trizol試劑提取樣品組織總RNA，作為模板進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，擴(kuò)增HSP70和GAPDH片段，其中GAPDH片段作為內(nèi)參照。引物根據(jù)文獻(xiàn)[5]進(jìn)行設(shè)計(jì)，由大連TaKaRa公司合成。HSP70上游引物：5'-AGCGTAAC ACCACCATTCC-3'，下游引物：5'-TGGCTCCCACCCTA TCTC-3'；GAPDH上游引物：5'-TGAAAGTCGGAGTCA ACGGAT-3'，下游引物：5'-ACGCTCCTGGAAGATAGT GAT-3'。根據(jù)設(shè)計(jì)引物，將得到GAPDH 230bp和HSP70372bp的片段。擴(kuò)增兩段DNA片段的PCR條件相同：42℃反轉(zhuǎn)錄50min，95℃預(yù)變性5min，94℃30s，58℃30s，72℃30s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸8min。反轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物作1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.3 RT-PCR擴(kuò)增片段的亞克隆 將GAPDH和HSP70擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠回收后，加入pGEM-T Easy載體和連接液，4℃放置過夜。取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM 109感受態(tài)菌株，SOC培養(yǎng)基37℃振蕩培養(yǎng)3h，取培養(yǎng)液接種到LB平板(含氨芐青霉素、IPTG和X-Gal)，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑選單克隆菌落在SOC培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和序列分析，選出用于體外轉(zhuǎn)錄的陽性質(zhì)粒，-20℃保存。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 將1.2.3所得到的陽性質(zhì)粒用ScaI酶進(jìn)行限制性酶切，使質(zhì)粒線性化，經(jīng)堿性苯酚、氯仿抽提純化后用于體外轉(zhuǎn)錄；體系為：5×Buffer 4μl，100mol·L-1 DTT 2μl，25nmol·L-1 rATP 1μl，25nmol·L-1 rGTP 1μl，25nmol·L-1 rUTP 1μl，25nmol·L-1 rCTP 1μl，線性化的質(zhì)粒(約0.8mg·mL-1)1.5μl，T7 RNA聚合酶1μl，RNA酶抑制劑1μl，DEPC處理水6.5μl，總體系為20μl。37℃作用2h。加入DNaseI酶2μl，37℃作用15min，除去線性化的質(zhì)粒DNA，產(chǎn)物經(jīng)酸性苯酚/氯仿、氯仿/異戊醇抽提，所得RNA沉淀溶解于20μl DEPC處理水中。取3μl在含有溴化乙錠(Ethidium Bromide, EB)的1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，檢測體外轉(zhuǎn)錄RNA的質(zhì)量。其余的RNA分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｓ煤怂釡y定儀測定RNA標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，進(jìn)一步換算成拷貝數(shù)。對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行一步法RT-PCR鑒定。將鑒定好的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10-3～10-7系列梯度稀釋，進(jìn)行一步法熒光定量RT-PCR反應(yīng)，每個(gè)樣品兩個(gè)重復(fù)，以模板起始拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)樣品臨界循環(huán)數(shù)(Threshold cycle，Ct)為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)方程。

1.2.5 樣品HSP70mRNA的定量分析 將組織樣品在液氮存在的條件下進(jìn)行研磨，利用Trizol試劑提取樣品組織中的總RNA，作為模板進(jìn)行熒光定量RT-PCR反應(yīng)，得到各樣品的Ct值，根據(jù)得到的標(biāo)準(zhǔn)方程換算mRNA的初始拷貝數(shù)。利用得到GAPDH mRNA初始拷貝數(shù)對得到的HSP70mRNA初始拷貝數(shù)進(jìn)行歸一化處理，比較各組織樣品中HSP70mRNA轉(zhuǎn)錄水平的差異。如果一個(gè)樣品HSP70的擴(kuò)增曲線Ct值為Ct70，GAPDH的擴(kuò)增曲線Ct值為Ctg。那么反應(yīng)管中HSP70的模板量(X70)為：X70=10 (Ct70-52.535)/-3.129，反應(yīng)管中GAPDH的模板量(Xg)為：Xg=10(Ctg-51.737)/-3.317，該組織HSP70的量用該組織中的GAPDH的量進(jìn)行歸一化，即X70與Xg相除：X70/Xg= 10(Ct70-52.535)/-3.129-(Ctg-51.737)/-3.317。這樣就可得到該反應(yīng)管中HSP70mRNA相對于該樣品持家蛋白基因GAPDH的含量。

1.2.6 分析及統(tǒng)計(jì) 利用軟件SPSS進(jìn)行t檢驗(yàn)，判定組間hsp mRNA相對量的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 陽性質(zhì)粒的PCR鑒定

GAPDH和HSP70的一步法RT-PCR采用25μl反應(yīng)體系，模板加5μl，得到特異的230和372bp擴(kuò)增條帶。瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，連接pGEM-T Easy載體，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)菌株。通過藍(lán)白斑篩選，得到陽性菌落，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，得到特異的230和372bp擴(kuò)增條帶(圖1)。

圖1 陽性質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

將鑒定好的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10-3～10-7系列梯度稀釋，進(jìn)行一步法熒光定量RT-PCR反應(yīng)，以模板起始拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)樣品臨界循環(huán)數(shù)(Threshold cycle，Ct)為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)方程。

圖2 體外轉(zhuǎn)錄HSP70 RNA模板10-3～10-7系列稀釋制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 體外轉(zhuǎn)錄GAPDH RNA模板10-3～10-7系列稀釋制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

熒光定量RT-PCR擴(kuò)增HSP70的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y＝-3.129X＋52.535(r=1.000)；GAPDH的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y＝-3.317X＋51.737(r=0.998)。其中Y代表Ct值，X代表模板量的對數(shù)值。結(jié)果顯示標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率都接近理想值-3.322，相關(guān)系數(shù)也接近1.000，說明在10-3～10-7的稀釋范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系(圖1～2、圖1～3)。

2.3 樣品HSP70mRNA的定量

通過熒光定量RT-PCR得到不同樣品反應(yīng)的臨界循環(huán)數(shù)，利用標(biāo)準(zhǔn)方程得到模板起始拷貝數(shù)對數(shù)值，進(jìn)一步獲得HSP70和GAPDH mRNA的拷貝數(shù)。二者的比值即為歸一化數(shù)值，為本試驗(yàn)的最終數(shù)據(jù)。

表1 雞馬立克氏病雞肝臟中HSP70mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化

表2 雞馬立克氏病雞脾臟中HSP70mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化

由表1可見，雞馬立克氏病毒攻毒后，肝臟HSP70mRNA的轉(zhuǎn)錄水平從21日齡后與空白組、疫苗組相比均極顯著增高(P＜0.01)，而疫苗組與空白組差異不顯著(P＞0.05)。

由表2可見，雞馬立克氏病毒攻毒后，脾臟HSP70mRNA的轉(zhuǎn)錄水平從21日齡后與空白組、疫苗組相比均極顯著增高(P＜0.01)，而疫苗組與空白組差異不顯著(P＞0.05)。

3 討論

HSP70能夠保護(hù)細(xì)胞內(nèi)重要的遺傳物質(zhì)DNA，防止細(xì)胞的凋亡，是癌細(xì)胞存活的重要條件。食管鱗癌組織中HSP70的表達(dá)水平顯著高于正常黏膜。利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)特異的減少腫瘤細(xì)胞系中HSP70的表達(dá)量，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞大量凋亡，證明HSP的表達(dá)是人類癌細(xì)胞存活的先決條件[6]。在DNA受損而發(fā)生凋亡的細(xì)胞中，細(xì)胞內(nèi)HSP70水平較正常二倍體細(xì)胞明顯減少，從而為HSP70能夠保護(hù)細(xì)胞內(nèi)重要遺傳物質(zhì)DNA找到了更為直接的證據(jù)。細(xì)胞在受到熱刺激時(shí)，HSP70表達(dá)增加并逐步向細(xì)胞核內(nèi)聚集；用HSP70表達(dá)抑制劑抑制HSP70表達(dá)后，細(xì)胞核的損傷加重。當(dāng)乳腺癌細(xì)胞接受預(yù)熱處理后，細(xì)胞內(nèi)HSP70增加，此時(shí)細(xì)胞對一些本來較敏感的抗癌藥物產(chǎn)生耐受，而這些藥物正是通過破壞DNA而殺死腫瘤細(xì)胞的。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)雞馬立克氏病毒引發(fā)腫瘤時(shí)，雞肝臟和脾臟內(nèi)HSP70的轉(zhuǎn)錄水平極顯著高于疫苗組和空白組，而疫苗組和空白組試驗(yàn)雞肝臟和脾臟內(nèi)HSP70的轉(zhuǎn)錄水平差異不顯著，說明攻毒組HSP70的增高是因?yàn)榘l(fā)生腫瘤引起的，而不是馬立克氏病毒感染引起。

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1007-1733(2013)09-0007-03

2013–07–05）