周洪娟 崔言順 （山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 泰安 271018）

魏可鵬 張立東 （臨沂出入境檢驗檢驗局）

QuEChERS-聯(lián)免疫吸附法檢測動物源性產(chǎn)品中阿維菌素殘留

周洪娟 崔言順 （山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 泰安 271018）

魏可鵬 張立東 （臨沂出入境檢驗檢驗局）

本研究采用QuEChERS凈化法，樣品用乙腈提取，ODS吸附劑粉分散固相萃取凈化，檢測動物源性食品中的阿維菌素。該方法的最低檢測限1.0μg/kg，回收率在68.3%～85.6%之間。通過3種不同種類動物源性產(chǎn)品中阿維菌素殘留量的檢測表明，該方法穩(wěn)定、可靠，能滿足動物源性食品中阿維菌素類藥物殘留檢測需要。

QuEChERS ELISA 阿維菌素類藥物殘留 檢測

阿維菌素類藥物是現(xiàn)在獸醫(yī)臨床應(yīng)用最廣泛的廣譜、高效的大環(huán)內(nèi)脂類抗寄生蟲藥物。特別是對家畜的胃腸道線蟲、體外寄生蟲有特殊療效。但作為脂溶性化合物，在動物體內(nèi)殘留時間長，按世界衛(wèi)生(WHO)的5級分級標(biāo)準(zhǔn)，阿維菌素藥物屬于高毒化合物。美國、歐盟、日本等國家紛紛制定了阿維菌素類藥物的最高殘留限量，2002年12月我國農(nóng)業(yè)部也對阿維菌素的最高殘留限量有了新的標(biāo)準(zhǔn)，并將檢測農(nóng)獸藥中阿維菌素類藥物的殘留量列為監(jiān)控的重點。

阿維菌素藥物目前的主要檢測方法有：酶聯(lián)免疫吸附試驗、液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜等儀器方法。而與儀器方法相比，酶聯(lián)免疫法具有檢測成本低，操作簡單，靈敏度高，可進(jìn)行大批量檢測等優(yōu)點。致使國外發(fā)達(dá)國家將免疫分析技術(shù)，色譜分析技術(shù)共同列為獸藥殘留的分析技術(shù)。肉制品組織中阿維菌素類藥物的凈化方法主要有液液萃取、固相柱萃取(SPE)、分散固相萃取法(QuEChERS)以及超臨界流體萃取等方法。QuEChERS方法是2003年由美國化學(xué)家Steven J.Lehotay和德國化學(xué)家Michelangelo Anastassiadas提出的一種快速、簡單、低成本的樣品處理方法，該方法的關(guān)鍵是采用分散固相萃取凈化法，即提取直接加入乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)吸附劑粉末進(jìn)行凈化，經(jīng)離心后用于儀器的檢測。該方法回收率高，精確度高，溶劑適用量少，污染少，操作簡單，且樣品制備過程簡單，成本較低。在農(nóng)獸藥殘留分析中使用也越來越廣泛。

1 材料與方法

1.1 儀器 MK3酶標(biāo)儀、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、均質(zhì)器(IKA T25)、震蕩器(IKA MSI)、高速冷凍離心機、天平：感量0.001g、2ml一次性注射器微量移液器，0.45μm針頭過濾膜，5～50μl、20～200μl、多道50～300μl。

1.2 試劑與材料 乙腈(分析純)、無水硫酸鎂(分析純)、ODS吸附劑購自Agela Technologlogies INC；阿維菌素酶聯(lián)免疫試劑盒；北京望爾生物技術(shù)有限公司提供。試驗樣品購自超市。

1.3 組織樣品前處理方法 稱取3±0.003g樣品，加入9ml乙腈，振蕩提取20min，110000g以上離心10min，取上清液4ml。置40℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入1ml稀釋了的復(fù)溶液和100mgODS吸附劑粉，1400r/m渦旋混勻2min，4500g 15min 5℃離心。取上清液過0.45μm針頭過濾膜，收集濾液，取20μl進(jìn)行ELISA試驗分析。

1.4 酶聯(lián)免疫試劑盒的檢測步驟 （1）將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫(20～24℃)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2～8℃不要冷凍。（2）編號：將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣品和標(biāo)準(zhǔn)品均需做2孔。用加樣器每孔加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本20L后，每孔再加80L抗體溶液。用蓋板膜蓋板后置于37℃環(huán)境反應(yīng)30min。小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌液每孔250L充分洗滌4～5次，每次間隔10～20s，用吸水紙拍干。（3）加酶標(biāo)記物：每孔加入100L。用蓋板膜蓋板后置37℃環(huán)境反應(yīng)30min，取出重復(fù)洗板步驟。顯色：每孔加入底物液A液50L，再加底物液B液50L，輕輕振蕩混勻37℃環(huán)境避光顯色15min。（4）測定：每孔加入終止液50L，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處(建議用雙波長450/630nm檢測)，測定每孔OD值。

1.5 結(jié)果判定 所獲得的每個濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的平均值(B)除以第一個標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(B0)再乘以100%，即百分吸光度值。

附圖 阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)曲線

2 結(jié)果

2.1 方法的驗證 按QuEChERS方法凈化后，對空白樣品加標(biāo)方法進(jìn)行回收率試驗，分別對豬肉、牛肉、雞肉進(jìn)行了3個水平的加標(biāo)，每個水平平行測定6次，提取后 ，計算樣品的加標(biāo)回收。用回收率來表示檢測方法的準(zhǔn)確度，結(jié)果見附表。

根據(jù)此表可以看出，用QuEChERS前處理，在豬肉組織樣品中阿維菌素的添加回收率在65.4%～92.7%之間，在牛肉組織樣品中阿維菌素的添加回收率在70.2%～94.1%之間，在雞肉組織樣品中阿維菌素的添加回收率在74.6%～92.5%之間。所有樣品的平均回收率在65.4%～94.1%之間。變異系數(shù)在2.38%～11.01%。

附表 阿維菌素回收率試驗 (μg/kg、%)

3 討論

阿維菌素類藥物微溶于正己烷，影響其回收率，因此選用乙腈代替正己烷；用QuEChERS前處理的分散固相萃取技術(shù)中的ODS粉對目標(biāo)物的吸附少，優(yōu)于C18粉，同時可以很好地吸附脂肪酸，色素等雜質(zhì)；其次與堿性氧化鋁柱相比，操作簡便，節(jié)省時間，不同于阿維菌素試劑盒中高脂肪組織的前處理。

4 結(jié)語

本文將QuEChERS技術(shù)引入到阿維菌素獸藥殘留分析的樣品前處理過程，代替原有的ELISA方法中堿性氧化鋁柱的過柱，溶劑適用量少，污染少，使之操作步驟簡化，檢測時間縮短，實用性更強。本試劑盒的最低檢測限(堿性氧化鋁柱過柱)為1.0μg/kg，運用QuEChERS方法，在最低檢測限附近添加回收率在68.3%～85.6%之間，符合檢測要求。該方法回收率高，精確度高，溶劑適用量少，污染少，操作簡單，且樣品制備過程簡單，成本較低。為進(jìn)一步大批量處理篩選檢測樣品提供參考。

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