張艷杰 胡立華 陳鵬 馮春 劉鑫

葉酸受體α(folate receptor alpha，F(xiàn)RA)是一種糖蛋白，其蛋白分子以糖基化磷脂酰肌醇(GPI)錨定于細(xì)胞膜上，主要介導(dǎo)葉酸入胞主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)［1］。FRA在正常組織中幾乎不表達(dá)，而在多種上皮組織來(lái)源的腫瘤組織中高表達(dá)，如鼻咽癌、非黏液性卵巢癌、子宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、腎癌及胰腺癌等。本實(shí)驗(yàn)研究FRA在原發(fā)性肝癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)情況，為原發(fā)性肝癌的靶向治療奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2006～2011年我院和黑龍江省醫(yī)院手術(shù)切除的原發(fā)性肝癌及肝活檢診斷的原發(fā)性肝癌標(biāo)本45例，其中男28例，女17例，年齡33～75歲，平均58.3歲，按2010年巴塞羅那臨床肝癌分期，早至中期33例，進(jìn)展期12例，所有患者均未接受任何抗腫瘤治療，病理類(lèi)型均為肝細(xì)胞性肝癌。肝硬化標(biāo)本為同期肝活檢標(biāo)本32例，其中男22例，女10例，年齡36～70歲，平均56.7歲。來(lái)源于肝血管瘤、肝囊腫周?chē)? cm以外及外傷性肝切除的正常肝組織標(biāo)本20例，其中男6例，女14例，年齡23～70(平均43.5)歲。原發(fā)性肝癌細(xì)胞系HEPG2和宮頸癌細(xì)胞系Hela購(gòu)自黑龍江省腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所，常規(guī)方法復(fù)蘇，15%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液、37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕度培養(yǎng)，0.25%胰酶消化傳代。

1.2 主要試劑 葉酸受體α單抗購(gòu)自深圳晶美生物工程有限公司，SP免疫組化試劑盒購(gòu)自福州邁新公司。

1.3 檢測(cè)方法 將原發(fā)性肝癌細(xì)胞及宮頸癌細(xì)胞爬片固定，原發(fā)性肝癌、肝硬化及正常肝組織的石蠟標(biāo)本重新制備切片，常規(guī)二甲苯脫蠟，熱修復(fù)處理后采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)，具體操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定 以細(xì)胞膜被染成棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞，隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)高倍鏡視野下的細(xì)胞，按照陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占全部細(xì)胞的比例分為:(-)陽(yáng)性細(xì)胞﹤5%;(+)陽(yáng)性細(xì)胞5% ～25%;(++)陽(yáng)性細(xì)胞25% ～75%;(+++)陽(yáng)性細(xì)胞﹥75%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料的組間比較采用卡方檢驗(yàn)，臨床病理資料分析采用Fisher's確切概率法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

表1 葉酸受體α在原發(fā)性肝癌、肝硬化及正常肝組織中的表達(dá)(例，%)

2.1 葉酸受體α在原發(fā)性肝癌、肝硬化和正常肝組織中的表達(dá) 免疫組化染色結(jié)果顯示88.9%的原發(fā)性肝癌組織表達(dá)葉酸受體α(40/45)，其中強(qiáng)陽(yáng)性12例，陽(yáng)性18例，弱陽(yáng)性10例;肝硬化組織中僅6例(18.8%)表達(dá)葉酸受體α，其中陽(yáng)性2例，弱陽(yáng)性4例;而正常肝組織中未見(jiàn)葉酸受體α表達(dá)(0/20)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(χ2=59.623，P ＜0.001)見(jiàn)表 1。進(jìn)展期原發(fā)性肝癌組織中葉酸受體α陽(yáng)性比例高于早-中期原發(fā)性肝癌組織，而與性別、年齡等因素?zé)o明顯相關(guān)性，見(jiàn)表2。

表2 葉酸受體表達(dá)與原發(fā)性肝癌臨床和病理特征的關(guān)系(例，%)

2.2 葉酸受體α在原發(fā)性肝癌細(xì)胞中的表達(dá) 免疫組化染色結(jié)果顯示:葉酸受體α在原發(fā)性肝癌細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，原發(fā)性肝癌細(xì)胞膜上呈現(xiàn)棕黃色染色，其表達(dá)水平與已知高表達(dá)的Hela細(xì)胞相當(dāng)。

3 討論

葉酸是一種人體必需的水溶性維生素，是包括核苷酸從頭合成在內(nèi)的一碳單位轉(zhuǎn)移反應(yīng)的輔因子，在涉及DNA及RNA合成、表觀遺傳過(guò)程、細(xì)胞增殖與生存的代謝過(guò)程中扮演關(guān)鍵角色。研究表明，葉酸缺乏與DNA損傷、甲基化畸形密切相關(guān)，而后者是腫瘤發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。葉酸受體是細(xì)胞膜表面糖基化的磷脂酰肌醇錨定的糖蛋白，可與5-甲基四氫葉酸及游離葉酸特異結(jié)合，并且通過(guò)受體介導(dǎo)的胞吞機(jī)制將葉酸及其衍生物高效、特異的載入細(xì)胞［2］。葉酸受體有α、β、和γ三種亞型，F(xiàn)RA分子量為38000 ～40000 mr，含有257個(gè)氨基酸，與葉酸具有高度親和力。目前研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)RA在正常組織中幾乎不表達(dá)，而在多種上皮組織來(lái)源的腫瘤組織中高表達(dá)，且與腫瘤病理特征有一定聯(lián)系［3，4］。

目前，已有學(xué)者利用葉酸對(duì)葉酸受體的高度親和性，將分子影像探針與葉酸偶聯(lián)，靶向至腫瘤組織，對(duì)小鼠的腫瘤組織進(jìn)行了成功的核磁共振分子顯像用于腫瘤的診斷［5］。原發(fā)性肝癌(primary carcinoma of the liver)是指由肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管細(xì)胞發(fā)生的腫瘤，是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。原發(fā)性肝癌早期癥狀隱匿，病史較長(zhǎng)，不易被及時(shí)診斷。臨床多見(jiàn)諸多患者到了疾病晚期出現(xiàn)嚴(yán)重的并發(fā)癥如:消化道出血、肝性腦病、頑固性腹水、肝癌破裂、肝腎、肝肺綜合征等才得以就醫(yī)。這時(shí)往往失去了最佳治療時(shí)機(jī)，不僅療效極差，而且給患者及家屬在經(jīng)濟(jì)和思想上帶來(lái)極大負(fù)擔(dān)。因此提高原發(fā)性肝癌的早期診斷率及提高治療效果意義非常重大。目前原發(fā)性肝癌診斷主要依據(jù)甲胎蛋白升高及彩超、CT和/或MRI等影像學(xué)方法。但對(duì)于小肝癌和早期肝癌影像學(xué)診斷率低，多采用肝活檢行病理組織學(xué)診斷，但不易為患者接受。核磁共振分子顯像是近年來(lái)出現(xiàn)的新技術(shù)，對(duì)早期實(shí)體腫瘤的診斷具有重要意義。本研究表明，葉酸受體α在原發(fā)性肝癌組織及細(xì)胞中高表達(dá)，且臨床分期晚的原發(fā)性肝癌葉酸受體陽(yáng)性率更高，這與其他學(xué)者對(duì)子宮內(nèi)膜癌、肺癌的研究結(jié)果一致［6，7］，為利用葉酸受體靶向磁共振診斷早期原發(fā)性肝癌提供依據(jù)。

另外，由于葉酸與其受體具有高親和力、自身穩(wěn)定性高、低免疫原性、低分子質(zhì)量、無(wú)需修飾，與有機(jī)物和無(wú)機(jī)鹽均有良好的相容性等優(yōu)點(diǎn)，而成為腫瘤靶向的理想配體。如今，很多化學(xué)的、生物的治療劑已成功地包載入葉酸，提高其在葉酸受體陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)。本研究表明，葉酸受體α在原發(fā)性肝癌組織及細(xì)胞中高表達(dá)，利用葉酸受體與葉酸的高親和力，應(yīng)用包載入葉酸的制劑治療原發(fā)性肝癌可大大提高療效，減少副反應(yīng)。

綜上所述，葉酸受體α的表達(dá)與原發(fā)性肝癌的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系，為利用葉酸受體靶向磁共振診斷早期原發(fā)性肝癌提供了理論基礎(chǔ)，并且可能為原發(fā)性肝癌的治療提供新視角。

［1］Spinella MJ，Brigle KE，Sierra EE，et al.Distinguishing between folate receptor-alpha-mediated transport and reduced folate carriermediated transport in L 1210 leukemia cells.J Biol Chem，1995，270(14):7842-7849.

［2］Kamen BA，Smith AK.A review of folate receptor alpha cycling and 5-methylterahydrofolate accumulation with an emphasis on cell models in vitro.Adv Drug Deliv Rev，2004，56(8):1085-1097.

［3］Shia J，Klimstra DS，Nitzkorski JR，et al.Immunohistochemical expression of folate receptor alpha in colorectal carcinoma:patterns and biological significance.Hum Pathol，2008，9(4):498-505.

［4］Brown JM，Neuper C，Clayton A，et al.Rationale for folate receptor alpha targeted therapy in“high risk”endometrial carcinomas.Int J Cancer，2008，123(7):1699-1703.

［5］Konda SD，Wang S，Brechbiel M，et al.Biodistribution of a 153 Gd-folate dendrimer，generation=4，in mice with folate-receptor positive and negative ovarian tumor xenografts.Invest Radiol，2002，37(4):199-204.

［6］Iwakiri S，Sonobe M，Nagai S，et al.Expression status of folate receptor alpha is significantly correlated with prognosis in non-smallcell lung cancers.Ann Surg Oncol，2008，15(3):889-899.

［7］Allard JE，Risinger JL，Morrison C，et al.Overexpression of folate binding protein is associated with shortened progression-free survival in uterine adenocarcinomas.Gynecol Oncol，2007，107(1):52-57.