潘春燕 蔡朝民 謝春英 王燮衡

解脲支原體（Ureaplasma Urealyticum,UU）是條件致病菌，當(dāng)機(jī)體免疫力下降、菌群失調(diào)、長期使用抗生素時(shí)能迅速繁殖，其黏附在泌尿道上皮細(xì)胞表面[1-2]。UU常引起非淋菌性陰道炎，UU感染還可導(dǎo)致不育、早產(chǎn)、慢性前列腺炎等[3]。臨床對UU的確診主要依靠實(shí)驗(yàn)診斷，實(shí)驗(yàn)室對UU的檢查方法主要有熒光PCR、培養(yǎng)、酶鏈免疫試驗(yàn)等。熒光PCR技術(shù)采用一對PCR引物和一個(gè)熒光雙標(biāo)記的探針，該探針能與引物擴(kuò)增區(qū)域中間的一段模板發(fā)生特異性結(jié)合，從而將PCR技術(shù)和熒光檢測技術(shù)結(jié)合起來，實(shí)現(xiàn)了對UU核酸的自動(dòng)化檢測。培養(yǎng)法不需要特殊設(shè)備，操作簡單，同時(shí)還可以做藥敏試驗(yàn)，目前臨床上普遍使用此法來檢測解脲支原體。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，熒光PCR技術(shù)在檢測病原體方面得到越來越廣泛的應(yīng)用。本文通過收集856 例樣本，分別采用熒光PCR和培養(yǎng)法檢測解脲支原體，對檢測結(jié)果進(jìn)行分析比較，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源 856 例患者均為2010年1月-2012年1月廣東省深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院接診的女性病例，年齡18～57歲。

1.2 試劑 熒光PCR UU檢測試劑盒由深圳匹基公司提供，UU液體培養(yǎng)基由珠海銀科生物技術(shù)應(yīng)用研究所提供。

1.3 儀器 ABI Gene Amp 7700 熒光PCR擴(kuò)增儀(美國ABI公司)、高速低溫離心機(jī)（Sigma公司）、干式恒溫器（ 杭州藍(lán)焰科技有限公司）、低溫冰箱（SANYO公司）、恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 標(biāo)本的采集 所有患者均用窺陰器暴露宮頸后，先用棉拭子擦去宮頸口過多的黏液，再用另一根棉拭子插入宮頸管內(nèi)1～2 cm處，停留10～30 s后緩慢旋轉(zhuǎn)1 周，取出分別置于兩根無菌試管內(nèi)待檢。

1.4.2 培養(yǎng)方法及結(jié)果判定 將待檢拭子在取出后半小時(shí)內(nèi)接種于UU培養(yǎng)液中，置于37℃ 5%～10% CO2和90%～95% N2環(huán)境中，每天觀察結(jié)果，培養(yǎng)24～48 h后液體培養(yǎng)基從淡黃色→淡紅色→紅色，且澄清無明顯沉淀者即為UU生長，結(jié)果陽性；不變色者為陰性；變紅色且渾濁者為細(xì)菌污染。

1.4.3 熒光PCR法檢測UU DNA

1.4.3.1 UU DNA模板制備 取待測樣本及陰、陽性對照品（試劑盒備有）各100 uL,分別加入到0.5 mL的離心管中，再分別加入100 uL DNA提取液1，震蕩混勻，13000 rpm離心10 min；吸棄上清液，再加入50 ul提取液2，震蕩混勻，100℃干浴10 min；冷至室溫后,13000 rpm離心10 min,保留上清液備用。

1.4.3.2 PCR擴(kuò)增 從試劑盒中取出UU DNA擴(kuò)增反應(yīng)液、Taq酶及UNG，室溫融化后按規(guī)定比例混合均勻，根據(jù)試劑盒說明書配制反應(yīng)液，分裝于PCR反應(yīng)管中，每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)1 管陰性對照，1 管陽性對照，將上述對照及標(biāo)本各加2 uL于加好反應(yīng)液的PCR反應(yīng)管中，上機(jī)擴(kuò)增。擴(kuò)增條件設(shè)置為37℃：5 min； 94℃：1 min；95℃：5 sec； 60℃:30 sec；再進(jìn)入40 個(gè)循環(huán)，反映體系設(shè)為40 uL。熒光信號(hào)收集時(shí)設(shè)定為Fam熒光素。

1.4.3.3 結(jié)果分析條件設(shè)定 取3-10 或3-15 個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)，閾值選定為剛好超過陰性對照品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)，且Ct值=40.0 為準(zhǔn)。

1.4.3.4 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn) 陰性對照的Ct值均應(yīng)等于40.0，陽性對照的Ct值應(yīng)小于等于30.0。

1.4.3.5 結(jié)果判斷 Ct值等于40 或0 的樣本為陰性標(biāo)本；檢測樣本Ct值≤37.0 者判為陽性；Ct值＞37.0 的樣本重做，重做結(jié)果Ct值＜40 為陽性，否則為陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

熒光PCR法檢測856 例樣本中的解脲支原體，351 例陽性，陽性率達(dá)41.0%，351 例熒光PCR法檢測陽性的樣本中有67 例培養(yǎng)法檢測陰性；培養(yǎng)法檢測856 例樣本，289 例陽性，陽性率達(dá)33.7%，其中5 例培養(yǎng)法檢測陽性的樣本熒光定量PCR法檢測為陰性；兩種方法檢測均陽性284 例。熒光PCR的陽性檢出率明顯高于培養(yǎng)法（P<0.05）,結(jié)果見表1。對67 例熒光PCR檢測陽性而培養(yǎng)法檢測陰性病例進(jìn)行病史及用藥史追蹤。

表1 熒光PCR和培養(yǎng)法UU檢測結(jié)果比較

3 討論

UU是一群大小介于細(xì)菌與病毒之間的病原體，臨床對UU的確診主要依靠實(shí)驗(yàn)診斷。熒光PCR技術(shù)敏感、快速，目前已常規(guī)的應(yīng)用到臨床一些病原體的檢測中，該技術(shù)把目的基因擴(kuò)增、特異分子雜交和熒光探針定量PCR技術(shù)融為一體，PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物分析的全過程均在單管封閉的條件下進(jìn)行，并通過微機(jī)控制，實(shí)現(xiàn)了對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測和結(jié)果的自動(dòng)分析[4]。培養(yǎng)法檢測UU，主要是利用UU可產(chǎn)生脲素酶分解尿素引起培養(yǎng)基變色的原理，根據(jù)指示劑是否變色來判斷結(jié)果的陰陽性。本文收集了856 例宮頸分泌物樣本，分別用熒光PCR技術(shù)和培養(yǎng)法檢測解脲支原體，對檢測結(jié)果進(jìn)行比較分析。

熒光PCR法檢測856 例樣本，351 例陽性，陽性率達(dá)41.0%，351 例熒光PCR法檢測陽性樣本中67 例培養(yǎng)法檢測呈陰性，造成這種差異的原因主要有：（1）熒光PCR技術(shù)敏感度比培養(yǎng)法高,熒光PCR是采用體外擴(kuò)增的方法，理論上只要存在病原體DNA即可檢出；（2）標(biāo)本的采集及標(biāo)本擱置的時(shí)間影響到檢測結(jié)果，培養(yǎng)法必須有一定存活的病原體存在才可檢出，標(biāo)本擱置時(shí)間過長易導(dǎo)致培養(yǎng)法檢測結(jié)果的假陰性，而熒光PCR法檢測則無需活的病原體存在，對死亡一段時(shí)間內(nèi)的病原體DNA仍可檢出；（3）污染造成檢測結(jié)果的假陽性。培養(yǎng)法檢測856 例樣本，289 例陽性，陽性率達(dá)33.7%，其中5 例培養(yǎng)法檢測陽性樣本熒光定量PCR檢測為陰性，出現(xiàn)這種情況的原因我們認(rèn)為主要有：（1）標(biāo)本中存在抑制Taq酶的因子；（2）模板提取缺失，未能提取到目的模板；（3）基因變異，UU變異后仍保留其分解尿素的特性，此時(shí)培養(yǎng)法檢測結(jié)果為陽性，而熒光PCR技術(shù)中引物設(shè)計(jì)是針對靶序列基因保守區(qū)的，未能檢出其變異基因[5]。

從檢測結(jié)果看，兩種方法的陽性檢出率有明顯差異（P<0.05），熒光PCR的陽性檢出率明顯高于培養(yǎng)法。我們對67例熒光PCR檢測陽性而培養(yǎng)法檢測陰性病例進(jìn)行病史和用藥史追蹤，發(fā)現(xiàn)有27 例患者在初診確認(rèn)為UU感染，經(jīng)藥物治療臨床癥狀已基本消失，此時(shí)患者的宮頸分泌物樣本用培養(yǎng)法檢測為陰性，而熒光PCR檢測仍為陽性。我們認(rèn)為患者支原體感染后的用藥監(jiān)測，采用培養(yǎng)法檢測病原體，結(jié)果更為客觀，這與陳春英等的結(jié)論基本一致[6]。對于初診，且尚未使用藥物的患者，以及對UU的流行病學(xué)調(diào)查研究可采用熒光PCR法，由于熒光PCR檢測結(jié)果無法反映UU的存活狀況，因此不適合用于藥物監(jiān)測。在UU檢測的方法學(xué)選擇上，我們認(rèn)為可以根據(jù)不同目的來選擇，結(jié)合熒光PCR及培養(yǎng)法，更能提高UU的檢測水平。

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