趙 蕊 蔡亞平 陳志寶 邵興月 賈桂燕

(八一農(nóng)墾大學(xué)生命學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

馬齒莧是我國古老的藥食兼用植物。近年來研究表明，馬齒莧具有調(diào)血脂、抗動脈硬化、抗腫瘤、抗衰老、降血糖等多種藥理活性〔1〕。多糖作為一種重要的生命物質(zhì)，具有多種生物活性，特別是抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)作用受到廣泛關(guān)注〔2〕。本文以馬齒莧為原料，研究馬齒莧多糖(PHP)亞級分對老齡荷U14宮頸癌實(shí)體瘤和腹水瘤模型小鼠的抑瘤作用。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 PHP亞級分由本實(shí)驗(yàn)室制備并鑒定;環(huán)磷酰胺(CTX)購于山西普德制藥廠;蘇木精、伊紅購于北京中山金橋生化試劑公司。試驗(yàn)中所用其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)動物和細(xì)胞株 昆明種小鼠(18～22)g，由協(xié)和醫(yī)院動物研究所提供。小鼠宮頸癌U14細(xì)胞株引自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，在小鼠腹腔中進(jìn)行傳代。

1.3 方法

1.3.1 PHP制備 馬齒莧→脫單糖、低聚糖→脫色→水提取→濃縮→脫蛋白→多糖沉淀→干燥→馬齒莧總多糖→離子交換層析→濃縮→脫鹽→冷凍干燥→馬齒莧多糖級分→凝膠柱層析→濃縮→冷凍干燥→PHP。

1.3.2 老齡小鼠模型制備 小鼠腹腔注射D-半乳糖(50 mg·kg－1·d－1)，連續(xù) 60 d。

1.3.3 小鼠急性毒性試驗(yàn) 預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明無法測出小鼠口服PHP的LD50，故改作1 d內(nèi)最大耐受量試驗(yàn)。取小鼠20只，雌雄各半。試驗(yàn)前禁食(不禁水)12 h，進(jìn)行小鼠急性經(jīng)口毒理試驗(yàn)，每日采用最大濃度、最大體積、一次性灌胃給藥，連續(xù)觀察7 d，記錄小鼠的行為、活動、攝食量、體重、糞便和死亡情況，未死亡的小鼠于1 w后處死進(jìn)行尸檢〔3〕。

1.3.4 急性毒性試驗(yàn)小鼠肝臟、腎臟病理切片觀察 急性毒性試驗(yàn)小鼠連續(xù)用藥7 d后，停藥1 w后將存活小鼠斷頸處死，無菌條件下迅速取出小鼠的肝臟和一側(cè)腎臟，中性緩沖甲醛固定液進(jìn)行固定，石蠟包埋，切片機(jī)切片，常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行病理學(xué)觀察。

1.3.5 急性毒性試驗(yàn)前、后小鼠血象的變化 急性毒性試驗(yàn)小鼠連續(xù)給藥7 d后，停藥1 w，摘眼球取血，抗凝后血細(xì)胞分析儀對小鼠紅細(xì)胞數(shù)(RBC)、白細(xì)胞數(shù)(WBC)和血紅蛋白(Hb)含量進(jìn)行檢測。

1.3.6 荷U14宮頸癌實(shí)體瘤、腹水瘤老齡小鼠模型的建立建模前小鼠禁食不禁水12 h。在無菌條件下，吸取在昆明種小鼠體內(nèi)傳代7～10 d的U14腫瘤細(xì)胞，生理鹽水調(diào)整細(xì)胞密度為5×106/ml，于小鼠左前肢腋窩皮下及腹腔各接種0.2 ml，接種成功率100%。

1.3.7 試驗(yàn)動物分組和處理 腫瘤接種后24 h，實(shí)體瘤老齡小鼠模型動物隨機(jī)分為4組，每組10只。而腹水瘤老齡小鼠模型動物隨機(jī)分為8組，4組用于腹水瘤腫瘤抑制率的測定，每組10只;4組用于生命延長率的測定，每組10只。每一試驗(yàn)的4組分別為 PHP低劑量組〔PHP(L)，100 mg/kg〕、PHP高劑量組〔PHP(H)，200 mg/kg〕、陰性對照組(Control，生理鹽水)和陽性對照組(CTX，25 mg/kg)。PHP(L)、PHP(H)處理組和Control組均采用灌胃給藥，CTX對照組采用腹腔注射給藥，給藥劑量為人每千克體重臨床用藥量的12倍。所有動物每日給藥1次，連續(xù)給藥13 d。

1.3.8 腫瘤抑制率和生命延長率的測定 停藥次日脫頸處死各組小鼠，取瘤塊肉眼觀察并進(jìn)行稱重，計算腫瘤抑制率;吸取腹腔中腹水，4%臺盼藍(lán)染色后，光學(xué)顯微鏡下計數(shù)腫瘤細(xì)胞數(shù)量;停藥后讓小鼠自然死亡，記錄存活天數(shù)，計算各組小鼠生命延長率。

1.3.9 PHP對宮頸癌U14肺轉(zhuǎn)移的干擾作用 無菌條件下，吸取在昆明種小鼠體內(nèi)傳代7～10 d的U14腫瘤細(xì)胞，生理鹽水調(diào)整細(xì)胞密度為5×105/ml，吸取0.1 ml注射入小鼠尾靜脈。分組方式如上所述，連續(xù)給藥13 d后，次日斷頸處死小鼠，迅速解剖出小鼠一側(cè)肺組織，顯微鏡下觀察肺組織并計數(shù)肺組織表面癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移克隆數(shù)〔4〕。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用Origin7.5軟件包，各組試驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，計量資料經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)為方差齊性，兩組間差異采用t檢驗(yàn)，多組資料采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 PHP用藥安全性檢測

2.1.1 急性毒性試驗(yàn)結(jié)果 對小鼠以PHP最大濃度最大體積進(jìn)行灌胃給藥，連續(xù)處理7 d，發(fā)現(xiàn)小鼠毛色光滑，活動、飲食、糞便色澤與質(zhì)地均正常，1 w內(nèi)無死亡及其他異?，F(xiàn)象發(fā)生。處死后進(jìn)行尸檢，各主要臟器(心、肝、脾、肺、腎)經(jīng)肉眼觀察未見明顯異常改變。

2.1.2 肝臟、腎臟病理切片觀察 光鏡下，急性毒性試驗(yàn)小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，中央靜脈居中，肝索向四周呈放射狀分布，肝細(xì)胞排列整齊，胞核清晰，胞質(zhì)豐富。急性毒性小鼠腎臟病理切片顯示，腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)明顯可見，腎細(xì)胞排列緊密，腎小球形狀規(guī)則，腎小管結(jié)構(gòu)清楚。表明PHP對小鼠肝臟、腎臟組織沒有形成明顯的毒性反應(yīng)。見圖1。

2.1.3 急性毒性試驗(yàn)前、后小鼠血常規(guī)的變化 急性毒性試驗(yàn)前、后，小鼠RBC、WBC及Hb含量均無顯著變化(P＞0.05)，各指標(biāo)均在正常范圍之內(nèi)，說明PHP對機(jī)體健康無明顯損傷。見表1。

表1 急性毒性試驗(yàn)前、后小鼠血常規(guī)變化(，n=10)

表1 急性毒性試驗(yàn)前、后小鼠血常規(guī)變化(，n=10)

?

2.2 PHP體內(nèi)對老齡小鼠宮頸癌U14實(shí)體瘤和腹水瘤的生長抑制作用 PHP(L)和PHP(H)兩組對小鼠移植性腫瘤均顯示出明顯的抑制作用，且小鼠精神狀態(tài)良好，體重平穩(wěn)增加，無死亡現(xiàn)象;Control組小鼠絕大部分精神狀態(tài)不佳，攝食量顯著減少，死亡3只，小鼠體重由于荷瘤也有所增加;而CTX組小鼠活躍，精神狀態(tài)良好，但體重增加不明顯。結(jié)果表明PHP對小鼠實(shí)體瘤具有抑制作用。為了進(jìn)一步檢測PHP體內(nèi)的抗腫瘤效果，我們通過腹腔注射U14細(xì)胞建立了老齡小鼠荷腹水型U14宮頸癌模型。結(jié)果表明，各藥物處理組小鼠腹水瘤腫瘤細(xì)胞數(shù)量均比Control組減少，提示PHP對腹水型老齡小鼠腫瘤的生長存在抑制作用。見表2，表3。

2.3 PHP對老齡荷瘤小鼠存活時間的影響 PHP(L)、PHP(H)和 CTX組小鼠的平均生存時間分別為(21.7±4.7)、(26.9±5.4)和(32.1±5.3)d，與 Control組〔(17.8±4.7)d〕相比，存活時間均顯著延長(P＜0.01)，其存活時間延長率分別為21.93%、51.46%及80.73%。雖PHP(L)組小鼠存活時間較CTX組短(P＜0.05)，但PHP(H)卻與之無顯著差異(P＞0.05)，提示PHP對老齡荷瘤小鼠生存時間有延長作用。

2.4 PHP對老齡小鼠宮頸癌U14肺轉(zhuǎn)移的干擾作用 宮頸癌U14細(xì)胞株為雙向高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株，一般在接種后第7天開始轉(zhuǎn)移，到第11天后可達(dá)80% ～100%肺和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。在宮頸癌肺轉(zhuǎn)移試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)PHP對小鼠宮頸癌肺轉(zhuǎn)移顯示出抑制作用。轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)Control組為(137.4±20.1)個，PHP(L)、PHP(H)和 CTX組分別為(103.9±15.1)、(84.7±11.8)和(90.8±17.6)個，肺轉(zhuǎn)移抑制率分別為 33.82%、24.57%、38.81%，提示PHP(L)、PHP(H)均對老齡小鼠宮頸癌U14的肺轉(zhuǎn)移有抑制作用，作用效果與CTX類似。

表2 PHP處理對小鼠宮頸癌U14實(shí)體瘤的生長抑制作用

表2 PHP處理對小鼠宮頸癌U14實(shí)體瘤的生長抑制作用

與Control組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與CTX對照組比:3)P＜0.05

?

表3 PHP處理對小鼠宮頸癌U14腹水瘤的生長抑制作用

表3 PHP處理對小鼠宮頸癌U14腹水瘤的生長抑制作用

與Control組比較:1)P＜0.01;與CTX組比較:2)P＜0.05

?

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，PHP(L)、PHP(H)對老齡小鼠宮頸癌的生長均有顯著抑制作用，另外，PHP(L)和PHP(H)均能夠顯著延長老齡荷瘤小鼠的存活時間。宮頸癌發(fā)生侵襲與轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因，淋巴轉(zhuǎn)移是宮頸癌主要的不良預(yù)后因素之一〔5〕。因此，控制侵襲和轉(zhuǎn)移成為宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)鍵因素，研發(fā)具有抗宮頸癌轉(zhuǎn)移的低毒新藥有著十分重要的意義。本研究結(jié)果表明，CTX對局部生長的腫瘤和循環(huán)性腫瘤的胞毒作用效果存在一定差異。CTX在以體重減輕為代價的基礎(chǔ)上可使實(shí)體腫瘤生長和腹水型腫瘤生長受到抑制，但對循環(huán)轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞這種破壞作用效果較弱。本研究結(jié)果支持局部生長的腫瘤和轉(zhuǎn)移的腫瘤具有不同的化學(xué)敏感性這一觀點(diǎn)〔6〕。在特定區(qū)域快速增殖的腫瘤細(xì)胞是抗癌藥物如CTX的作用靶點(diǎn)，而在血液和淋巴中循環(huán)的轉(zhuǎn)移細(xì)胞受DNA-靶性抗癌藥物的影響則較小。本研究結(jié)果卻表明，PHP在老齡小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出顯著抑制腫瘤生長作用的同時，對小鼠宮頸癌U14的肺轉(zhuǎn)移也存在顯著的抑制作用，其機(jī)制可能是由于PHP激活的免疫細(xì)胞在血液和淋巴器官中與循環(huán)的腫瘤細(xì)胞相遇，進(jìn)而對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行破壞所造成的，因此，PHP也大大降低了老齡小鼠宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險。宮頸癌局部的侵襲與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是腫瘤細(xì)胞與宿主細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)之間一系列復(fù)雜、多步驟、多因素相互作用的動態(tài)過程，具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

1 向 蘭，邢東明，王 偉，等.馬齒莧的化學(xué)成分研究進(jìn)展〔J〕.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2006;9(7):64-8.

2 崔 吳，尹 苗，安利國.馬齒莧多糖的抗腫瘤活性〔J〕.山東師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2002;17(1):72-6.

3 陳 奇.中藥藥理研究方法學(xué)〔M〕.北京:人民衛(wèi)生出版社，1994:1085-6.

4 Zou D，Shibuya M，Shinoda K，et al.The difference of angiogenesis in human lung adenocarcinoma cell lines with different metastatic potency〔J〕.J Nippon Med Sch，2004;71(3):181-9.

5 Kato R，Ishikawa T，Kamiya S，et al.A new type of antimetastatic peptide derived from fibronectin〔J〕.Clin Cancer Res，2002;8(3):2455-62.

6 Furukawa T，Kubota T，Watanabe M，et al.Immunochemotherapy prevents human colon cancer metastasis after orthotopic on plantation of histologically intact tumor tissue in nude mice〔J〕.Anticancer Res，1993;13(7):287-91.