朱永香 王 倩 王 爽 于 瑋 南 瑛 曹 健

(西安醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，陜西 西安 710021)

Ghrelin是由28個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，具有強(qiáng)烈的促食欲作用。最初發(fā)現(xiàn)Ghrelin主要是由胃底泌酸腺的X/A樣細(xì)胞產(chǎn)生，但后來(lái)Cowley等〔1〕報(bào)道腦內(nèi)尤其是下丘腦也能夠合成Ghrelin，而其陽(yáng)性突起在下丘腦以外的腦區(qū)也有分布，包括:杏仁中央核(CeA)、終紋床核、內(nèi)側(cè)杏仁核、杏仁皮質(zhì)核以及丘腦室旁核等部位。生長(zhǎng)激素促分泌素受體(GHS-R)是Ghrelin在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)發(fā)揮作用的受體，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的分布包括下丘腦、腦干以及邊緣系統(tǒng)的一些腦區(qū)〔2〕。盡管最初并未發(fā)現(xiàn)CeA內(nèi)有GHS-R的存在，但近來(lái)有研究用qRT-PCR方法檢測(cè)到CeA內(nèi)有GHS-R mRNA存在〔3，4〕。CeA是參與攝食行為調(diào)節(jié)的核團(tuán)之一，已有研究證實(shí)下丘腦外側(cè)區(qū)或室旁核注射Ghrelin激活了CeA內(nèi)的神經(jīng)元〔5，6〕。然而，至今并未發(fā)現(xiàn)Ghrelin在CeA內(nèi)對(duì)攝食調(diào)節(jié)作用的研究。本研究應(yīng)用核團(tuán)內(nèi)注射的方法觀(guān)察了給飽食大鼠CeA內(nèi)注射Ghrelin對(duì)攝食量的影響及對(duì)弓狀核c-Fos表達(dá)的影響;并觀(guān)察了給隔夜禁食大鼠CeA內(nèi)注射GHS-R阻斷劑D-Lys3-GHRP-6對(duì)攝食量的影響，擬探討外源性及內(nèi)源性Ghrelin在CeA內(nèi)對(duì)攝食的影響及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑及儀器 48只雄性 SD大鼠，體質(zhì)量220～240 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證:SCXK(陜)2008-002，使用許可證:SYXK(陜)2008-005。大鼠自由攝食飲水，室溫22～24℃。多克隆兔抗大鼠c-Fos抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，Ghrelin和GHS-R受體阻斷劑D-Lys3-GHRP-6均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，SP試劑盒(羊抗兔)及DAB濃縮型試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。主要儀器有大鼠腦立體定位儀(SN-3)、顯微鏡(Olympus，BX51)、照相機(jī)(Spot Insight，U3.5)及圖像分析軟件(Image-Pro Plus 6.0)。

1.2 CeA內(nèi)植入套管 將大鼠腹腔注射水合氯醛(40 mg/kg)麻醉，固定于立體定位儀上，將自制鋼套管植入左側(cè)CeA上方1 mm處(根據(jù)包新民大鼠腦立體定位圖譜:前囟后2.2 mm，向左旁開(kāi)4.5 mm，硬腦膜下6.5 mm)，并用牙科水泥固定。術(shù)后恢復(fù)8 d，痊愈后實(shí)驗(yàn)，狀態(tài)差者排除實(shí)驗(yàn)。

1.3 飽食大鼠CeA內(nèi)注射Ghrelin后攝食量的觀(guān)察 將16只術(shù)后大鼠隨機(jī)分為兩組，每組8只，自由攝食，分別用微量注射器向CeA內(nèi)注射(在套管下1.0 mm處持續(xù)2 min，停留2 min)生理鹽水(對(duì)照組)或Ghrelin 0.3 nmol(實(shí)驗(yàn)組)，分別測(cè)量1、2、4 h內(nèi)大鼠的攝食量。

1.4 飽食大鼠CeA內(nèi)注射Ghrelin后弓狀核內(nèi)c-Fos表達(dá)的觀(guān)察 將16只手術(shù)后大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組8只并自由攝食，分別用微量注射器向CeA內(nèi)注射生理鹽水(對(duì)照組)或Ghrelin 0.3 nmol(實(shí)驗(yàn)組)，2 h后灌流固定，斷顱取腦固定后，做冰凍冠狀切片，片厚40μm。SP免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)弓狀核內(nèi)c-Fos蛋白的表達(dá)。細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。在400倍光鏡下，選取有弓狀核的連續(xù)5張切片，并選取同一區(qū)域拍照，應(yīng)用IPP6.0軟件分析FOS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.5 隔夜禁食大鼠CeA內(nèi)注射GHS-R阻斷劑后攝食量的觀(guān)察 將16只手術(shù)后大鼠隨機(jī)分為2組，每組8只，隔夜禁食后，分別用微量注射器向CeA內(nèi)注射生理鹽水(對(duì)照組)或GHS-R阻斷劑D-Lys3-GHRP-6 200 nmol(實(shí)驗(yàn)組)后，測(cè)量1、2及4 h內(nèi)大鼠的攝食量。

1.6 套管位置鑒定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用20%烏拉坦(1 mg/kg)腹腔注射麻醉，CeA內(nèi)注入旁胺天藍(lán)0.5μl，灌流固定，開(kāi)顱取腦，置入10%甲醛中后固定。24 h后做連續(xù)冰凍冠狀切片，片厚50μm，光鏡下參照大鼠腦定位圖譜對(duì)套管位置進(jìn)行定位，排除位置不準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

表2 隔夜禁食大鼠CeA內(nèi)注射GHS-R阻斷劑后攝食量的變化，mg，n=8)

表2 隔夜禁食大鼠CeA內(nèi)注射GHS-R阻斷劑后攝食量的變化，mg，n=8)

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圖1 大鼠弓狀核內(nèi)c-Fos免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(SP，×400)

2 結(jié)果

2.1 飽食大鼠CeA內(nèi)注射Ghrelin后攝食量的變化 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，1、2、4 h內(nèi)的攝食量明顯增加(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 CeA內(nèi)注射Ghrelin后攝食量的變化，mg，n=8)

表1 CeA內(nèi)注射Ghrelin后攝食量的變化，mg，n=8)

與對(duì)照組比較:1)P＜0.05;表2同

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2.2 飽食大鼠CeA內(nèi)注射Ghrelin后弓狀核內(nèi)c-Fos表達(dá)的變化 對(duì)照組弓狀核內(nèi)c-Fos免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)較少，平均值為46.13±9.14，實(shí)驗(yàn)組弓狀核內(nèi)c-Fos免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)較多，平均值為93.88±21.09，與對(duì)照組比較差異顯著(P＜0.05)。見(jiàn)圖1。

2.3 隔夜禁食大鼠CeA內(nèi)注射GHS-R阻斷劑后攝食量的變化 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，1、2、4 h內(nèi)的攝食量明顯減少(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

3 討論

Ghrelin是GHS-R的內(nèi)源性配體，具有強(qiáng)烈的刺激攝食的作用。盡管胃是血液循環(huán)中Ghrelin的主要來(lái)源，并且外周注射Ghrelin可以產(chǎn)生強(qiáng)烈的攝食反應(yīng)。然而，中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)Ghrelin的攝食調(diào)控發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。給大鼠下丘腦的多個(gè)核團(tuán)內(nèi)如:弓狀核、下丘腦外側(cè)區(qū)、下丘腦室旁核以及腦干注射Ghrelin均可發(fā)動(dòng)攝食行為;另外，給中腦腹側(cè)被蓋區(qū)、伏核、海馬以及中縫背核注入Ghrelin同樣也出現(xiàn)了刺激攝食的作用〔7，8〕。由于Ghrelin突起及其受體GHS-R在CeA內(nèi)均有存在〔1，3，4〕，并且 CeA 對(duì)攝食具有調(diào)控作用，可增加進(jìn)食量，有理由推測(cè)Ghrelin在CeA內(nèi)可能同樣參與了攝食調(diào)節(jié)作用。

當(dāng)機(jī)體處于饑餓狀態(tài)時(shí)，下丘腦內(nèi)GHS-R mRNA表達(dá)上調(diào)，血漿中Ghrelin濃度升高，餐后血漿中Ghrelin水平降低。本研究結(jié)果提示Ghrelin在CeA內(nèi)的生物學(xué)效應(yīng)具有促進(jìn)攝食的作用。但有研究指出給大鼠杏仁基底外側(cè)核注射Ghrelin卻使液體食物的攝入量減少〔9〕，其原因可能是CeA和杏仁基底外側(cè)核在攝食調(diào)控中起不同的功能，CeA起正調(diào)控作用，可增加進(jìn)食量;杏仁基底外側(cè)核則起負(fù)調(diào)控作用，可減少攝食量。然而，也有研究顯示杏仁核內(nèi)注射Ghrelin對(duì)常規(guī)飼料的攝入無(wú)明顯影響〔10〕，其原因可能是由于Ghrelin注射進(jìn)入杏仁核不同的亞核，對(duì)攝食產(chǎn)生了或增加或降低的影響，綜合以后可能作用相互抵消，從而導(dǎo)致攝食沒(méi)有明顯變化。

弓狀核是下丘腦調(diào)節(jié)攝食的主要部位，腹腔、腦室及下丘腦外側(cè)區(qū)注射Ghrelin均能夠使弓狀核內(nèi)的神經(jīng)元激活，表明弓狀核在Ghrelin的攝食調(diào)控中發(fā)揮重要作用。本研究給飽食大鼠CeA內(nèi)注射Ghrelin導(dǎo)致弓狀核內(nèi)c-Fos表達(dá)也增多，其原因可能是Ghrelin注射入CeA后與該核團(tuán)內(nèi)GHS-R結(jié)合，導(dǎo)致CeA內(nèi)相應(yīng)的神經(jīng)元激活，從而間接激活了與CeA有纖維聯(lián)系的弓狀核。前面提及下丘腦室旁核或外側(cè)區(qū)注射Ghrelin能夠激活CeA內(nèi)的神經(jīng)元〔5，6〕，由此推測(cè)在CeA與下丘腦參與攝食調(diào)節(jié)的一些核團(tuán)之間可能存在復(fù)雜的神經(jīng)環(huán)路，使這些核團(tuán)相互聯(lián)系共同參與Ghrelin對(duì)攝食的調(diào)節(jié)作用，但仍需進(jìn)一步證實(shí)CeA與下丘腦參與攝食調(diào)控的核團(tuán)之間存在Ghrelin能神經(jīng)纖維投射。大量研究證實(shí)禁食使機(jī)體內(nèi)Ghrelin水平顯著提高，從而產(chǎn)生強(qiáng)烈的攝食驅(qū)動(dòng)作用〔11〕。給禁食大鼠腦室注射GHS-R阻斷劑抑制了饑餓大鼠的攝食〔12〕，提示內(nèi)源性Ghrelin在饑餓引起的攝食中具有重要作用。本研究結(jié)果提示內(nèi)源性Ghrelin在CeA內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可能與攝食調(diào)控有關(guān)，尤其是與能量不足導(dǎo)致的攝食行為有關(guān)。

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