易 嵐，譚 暉，吉曉霞，陳 歆，單 健，蘇 琦

(南華大學(xué)1.腫瘤研究所、2.藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，湖南衡陽 421001)

目前，激發(fā)或誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡已成為治療腫瘤的新方法［1］。研究表明，眾多的細胞因子和藥物具有誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的能力［2］。其中，大蒜及其烯丙基硫化物的抗癌作用正日益受到關(guān)注。有研究顯示［3］，大蒜主要有效成分二烯丙基二硫(diallyl disulfide，DADS)可誘導(dǎo)胃癌、肺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤細胞凋亡。我們前期工作已經(jīng)證明，DADS不僅可誘導(dǎo)人結(jié)腸癌等細胞分化與凋亡［4］，而且可誘導(dǎo)人白血病細胞分化與凋亡。DADS對人白血病細胞具有雙效作用，小劑量DADS(＜1.25 mg·L－1)誘導(dǎo)人白血病細胞分化，其機制與抑制 JAK1/STAT3的酪氨酸激酶活性、下調(diào)STAT3與Myc核內(nèi)表達水平，提高組蛋白乙酰化水平及p21WAF1表達上調(diào)有關(guān)［5］。而中等劑量 DADS(＞1.25 mg·L－1)可誘導(dǎo)人白血病細胞凋亡，其機制與G2/M期阻滯，抑制ERK和激活p38，下調(diào)Bag-1、Bcl-2，上調(diào)Fas-L、Bax 等有關(guān)［6－7］。但具體機制尚不清楚。

活性氧(reactive oxygen species，ROS)作為細胞內(nèi)非常重要的信號分子參與了細胞凋亡的啟動和執(zhí)行［8］。最新研究表明，ROS與 MAPKs信號通路密切相關(guān)［9］。在許多腫瘤細胞的凋亡過程中，ROS是JNK信號通路的重要調(diào)節(jié)者［10］。盡管在DADS作用的腫瘤細胞中，ROS的水平有明顯的上調(diào)，但ROS與其它信號分子在細胞凋亡過程中的相互作用仍不完全清楚。本研究旨在研究DADS通過ROS介導(dǎo)的JNK信號通路誘導(dǎo)人白血病K562細胞凋亡，進一步闡明白血病的發(fā)病機制，為白血病的誘導(dǎo)凋亡治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器DADS為Fluka公司產(chǎn)品，小牛血清是杭州四季青生物工程公司產(chǎn)品。蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(protein molecular weight marker)購于碧云天生物技術(shù)有限公司。BCA蛋白定量試劑盒為Pierce公司產(chǎn)品。2'，7'-二氯氫化熒光素二脂(DCFH-DA)為 Santa Cruz公司產(chǎn)品。N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)，JNK特異抑制劑sp600125購自Sigma公司。JNK抗體、phospho-JNK抗體以及相應(yīng)的二抗均為Abcam Biotechnology公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 細胞培養(yǎng)采用常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含10%小牛血清的RPMI 1640，在37℃，飽和濕度，5%CO2孵箱中培養(yǎng)，每3～4天換液傳代。取對數(shù)生長期細胞用于實驗，DADS用培養(yǎng)基稀釋到所需濃度。

1.2.2MTT檢測 用含10%胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以每孔103～104個細胞接種到96孔板，每孔體積100 μl，設(shè)3個復(fù)孔。加入處理因素并設(shè)0對照，空白對照(對照孔及調(diào)零孔加100 μl培養(yǎng)液)，溶酶對照和不同濃度DADS處理組。在37℃，飽和濕度，5%CO2孵箱中常規(guī)培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。于結(jié)束前4 h除0對照組外，每孔加MTT 溶液(5 g·L－1用 PBS 配制，pH=7.4)20 μl，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)。離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150 μl DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分融解。于酶聯(lián)免疫檢測儀上測各孔吸光度，檢測波長570 nm，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，按下列公式計算抑制率。

1.2.3凋亡細胞百分率檢測 調(diào)整待測細胞的濃度為5 ×108－1 ×109·L－1。1 000 r·min－1，離心5 min，收集培養(yǎng)細胞，預(yù)冷PBS吹打重懸，離心沉淀，重復(fù)1次。用4℃預(yù)冷的75%乙醇固定細胞，冰盒送檢。樣本上機前離心洗滌，棄上清，加碘化丙啶(PI)50 μl，濃度為 1 g·L－1，振蕩混勻，避光置冰箱30 min，上機檢測時300目尼龍網(wǎng)濾過，隨機計數(shù)10 000個細胞，進行DNA含量分析。DNA含量低于2n的細胞百分數(shù)為凋亡細胞百分率。

1.2.4細胞內(nèi)ROS檢測 收集細胞，用Hanks液洗滌細胞 2 次，加入終濃度為 10 μmol·L－1的DCFH-DA 400 μl，充分混勻，在 37℃條件下避光反應(yīng)50 min，用Hanks液洗滌細胞3次以去除細胞外熒光劑，用500 μl Hanks液重懸細胞，37℃條件下水浴10 min.流式細胞儀分析熒光強度，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm。

1.2.5Western blot檢測 細胞裂解:分別收集未處理組、處理組細胞，冰PBS洗兩次，以1×107個細胞濃度加入 100 ～150 μl裂解液(100 mmol·L－1NaCl，10 mmol·L－1Tris-HCl pH 7.6，1 mmol·L－1EDTA pH 8.0，1 mg·L－1Aprotinin，100 mg·L－1PMSF)，冰上裂解 1 h，12 000 r·min－1離心 10 min，吸出上清液，即為細胞總蛋白。根據(jù)Bradford法進行蛋白含量的測定。收集蛋白，變性后經(jīng)10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%牛血清白蛋白的TBST(Tris-HCl 20 mmol·L－1，NaCl 137 mmol·L－1含 0.1%Tween-20)封閉 1 h，用特異性一抗4℃孵育過夜，TBST洗3次，每次5 min，相應(yīng)的二抗孵育1 h，TBST洗3次，每次5 min，化學(xué)發(fā)光劑檢測蛋白質(zhì)印跡，薄層掃描儀測定印跡區(qū)帶的光密度值。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 12.0統(tǒng)計分析軟件，Student't-test法進行顯著性檢驗，用Sigma plot 9.0軟件進行繪圖。

2 結(jié)果

2.1DADS對K562細胞的增殖抑制作用如Tab 1 所示，2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mg·L－1DADS處理人白血病K562細胞，抑制率分別為32.48%、59.34%、66.42%、81.05%、87.09%，抑制率呈濃度依賴性增加(P＜0.05)。Tween80對照組對細胞增殖無明顯抑制作用(P＞0.05)。這些結(jié)果表明，DADS以劑量依賴性抑制K562細胞的生長。IC50值在 5.0 mg·L－1左右。

Tab 1 The OD570value of different concentration DADS treated K562 cells 48 hours(±s)

Tab 1 The OD570value of different concentration DADS treated K562 cells 48 hours(±s)

DADS/mg·L－1 OD570value IR/%Control 1.027 ±0.0408 2.5 0.6892 ±0.0367 32.48 5.0 0.415 ±0.0115 59.34 10.0 0.3428 ±0.0262 66.42 20.0 0.1934 ±0.0099 81.05 40.0 0.1325 ±0.0085 87.09 Tween80 1.0020 ±0.0354 2.433

2.2DADS對K562細胞內(nèi)ROS的影響DCFHDA染色后，流式細胞術(shù)檢測結(jié)果如Fig 1所示，5 mg·L－1DADS 處理人白血病 K562 細胞 0、1、2、4、8、12和24 h后，細胞熒光強度分別為7.9±1.08、10.1±1.24、12.5 ±0.63、15.9 ±1.47、26.1 ±0.99、20.8±1.56、12.7 ±0.65。結(jié)果表明:5 mg·L－1DADS作用 K562細胞，ROS水平在1 h內(nèi)迅速上升，8 h到達高峰，隨后的4 h又開始下降。

Fig 1 FCM analysis of K562 cells treated with 5.0 mg·L －1 DADS for different lengths of time

2.3DADS誘導(dǎo)人白血病K562細胞凋亡過程中JNK1/2的活化在DADS誘導(dǎo)人白血病K562細胞凋亡過程中有激酶JNK1/2的活化。如Fig 2所示，在DADS誘導(dǎo)K562細胞凋亡過程中，磷酸化JNK1/2表達水平呈時間依賴性，5 mg·L－1DADS作用K562細胞4h后，與未處理組想比，磷酸化JNK1/2表達水平明顯上升，8 h達到高峰，隨后表達開始下降，這和檢測到得ROS水平相一致。

Fig 2 Western blot analysis of JNK activation in K562 cells induced by different lengths of time with 5.0 mg·L －1DADS

2.4NAC和sp600125對DADS誘導(dǎo)K562細胞凋亡的影響如Fig 3所示，5 mg·L－1DADS作用K562細胞24 h，凋亡率為(38.6±2.12)%，與未處理組(3.2% ±0.76%)相比，5 mg·L－1DADS 能明顯誘導(dǎo)K562細胞凋亡，而10 mmol·L－1抗氧化劑NAC 和 10 μmol·L－1JNK 抑制劑sp600125并未能誘導(dǎo)細胞凋亡。在10 mmol·L－1NAC或10 μmol·L－1sp600125預(yù)處理后再用5 mg·L－1DADS作用細胞24 h，凋亡率分別為(15.8±1.76)% 和(17.1±1.54)%，這些結(jié)果表明用 NAC和sp600125預(yù)處理細胞能阻滯DADS誘導(dǎo)K562細胞凋亡(P＜0.05)(Fig 4)。

Fig 3 Flow cytometry(FCM)analysis of apoptosis of K562 cells induced by 5 mg·L－1DADS，with and without pretreatment with 10 mmol·L －1NAC or 10 μmol·L －1sp600125

Fig 4 Flow cytometry(FCM)analysis of apoptosis rate of K562 cells

2.5NAC和sp600125對K562細胞p-JNK1/2表達的影響為了進一步研究JNK的活化與ROS的關(guān)系，我們在 DADS誘導(dǎo)細胞凋亡中應(yīng)用了sp600125和NAC兩種抑制劑來檢測JNK的活化。Western blot分析結(jié)果如 Fig 5所示，在5 mg·L－1DADS作用30 min之前用sp600125或NAC預(yù)處理細胞，再用5 mg·L－1DADS作用8 h后，磷酸化JNK表達水平(尤其是磷酸化JNK1)表達水平明顯下降。結(jié)果表明:在DADS誘導(dǎo)人白血病K562細胞凋亡過程中有激酶JNK1/2的活化與ROS密切相關(guān)。

Fig 5 Effects of pretreatment with NAC and sp600125 on p-JNK1/2 activation in DADS-treated K562 cells

3 討論

刺激和誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡已經(jīng)成為治療腫瘤的一種新的可能性［11］。眾多的細胞因子和藥物都能誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，其中，大蒜及其烯丙基硫化物的抗腫瘤作用已日益吸引著人們的目光。DADS作為大蒜提取物中最有效的成分，可以誘導(dǎo)多種腫瘤細胞包括人慢性髓細胞性白血病K562細胞系凋亡，但是其具體機制還有待于進一步研究。

我們前期工作已經(jīng)表明，低劑量(1.25 mg·L－1)的 DADS具有抗增殖作用，能誘導(dǎo)人白血病K562細胞分化［12］。本研究用中等濃度(2.5～20 mg·L－1)DADS來誘導(dǎo)人白血病K562細胞凋亡。本研究進一步證實了DADS對人白血病K562細胞的生長抑制作用。MTT實驗結(jié)果表明，DADS以劑量依賴方式抑制人白血病K562細胞的活性。許多研究表明，各種刺激，比如抗腫瘤藥物、紫外線、離子輻射等都能刺激形成內(nèi)源性的ROS，這種內(nèi)源性的ROS在細胞的凋亡過程中起著非常重要的作用［13］。本研究中，用DADS處理人白血病細胞，細胞內(nèi)ROS水平明顯升高，呈時間依賴性方式。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，5 mg·L－1DADS作用K562細胞后，ROS水平在1 h內(nèi)迅速上升，8 h到達高峰，隨后的4 h又開始下降。而且，用抗氧化劑NAC或JNK抑制劑sp600125預(yù)處理細胞后再用5 mg·L－1DADS作用細胞24 h，凋亡率分別明顯下降(P＜0.05)。這些結(jié)果表明:DADS誘導(dǎo)人白血病細胞凋亡與ROS以及JNK有關(guān)。

大量研究已經(jīng)表明，MAPK信號通路的成員，包括ERKs、JNKs和 p38 MAPK信號通路在細胞的生存和死亡上起著非常重要的作用［14］。有研究發(fā)現(xiàn)［15］，在DADS誘導(dǎo)人白血病細胞凋亡過程中，細胞活化的磷酸化ERKs的水平降低了，而活化的p38 MAPK的表達水平升高。JNK在許多腫瘤細胞凋亡上起著非常重要的作用，用遺傳或者藥理學(xué)途徑抑制JNK的活性，可阻滯細胞的凋亡［16］。本研究結(jié)果表明，JNK特異性抑制劑 sp600125能明顯降低DADS誘導(dǎo)人白血病細胞凋亡的能力，可見，JNK通路參與了DADS誘導(dǎo)人白血病細胞凋亡。眾所周知，ROS是凋亡的啟動者和調(diào)節(jié)者，但ROS本身不能直接激活caspase的級聯(lián)反應(yīng)，因此ROS誘導(dǎo)凋亡需要其他一些物質(zhì)的參與，包括 JNK信號通路［17］。本研究實驗結(jié)果表明，在DADS誘導(dǎo)人白血病K562細胞凋亡過程中有JNK1/2的活化。Western blot分析結(jié)果顯示，5 mg·L－1DADS作用 K562細胞4 h后，與未處理組相比，磷酸化JNK1/2表達水平明顯上調(diào)，8 h達到高峰，隨后表達開始下降，這和檢測到的ROS水平相一致。為了進一步研究JNK的活化與ROS的關(guān)系，我們在DADS誘導(dǎo)細胞凋亡中應(yīng)用sp600125和NAC兩種抑制劑來檢測JNK的活化。在 DADS作用30 min之前用sp600125或 NAC預(yù)處理細胞，再用 5 mg·L－1DADS作用8 h后，磷酸化JNK表達水平(尤其是磷酸化JNK1)表達水平明顯下降。這些結(jié)果表明:在DADS誘導(dǎo)人白血病K562細胞凋亡過程中有激酶JNK1/2的活化，激酶JNK1/2的活化是由ROS來調(diào)節(jié)的。當(dāng)然，DADS誘導(dǎo)人白血病細胞K562凋亡的具體機制還有待于進一步研究。

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