蔡志欣 蔡丹鳳 陳美元 楊 菁 廖劍華 王澤生

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，福州 350014）

茯苓[Wolfiporia cocos (Schwein.)Ryvarden& Gilb.]是一種高等擔(dān)子菌，隸屬于非褶菌目、多孔菌科、茯苓屬。茯苓是中國(guó)傳統(tǒng)中藥材之一，有著悠久的栽培歷史。近年茯苓產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，但在茯苓生產(chǎn)中，由于菌種管理不夠規(guī)范，菌種生產(chǎn)單位各自命名，造成菌種名稱較為混亂，同種異名、同名異種現(xiàn)象普遍存在，極大地影響了產(chǎn)業(yè)的良性發(fā)展。

SRAP（sequence-related amplified polymorphis-m，序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性）技術(shù)是Li等[1]在2001年發(fā)展的一種新型分子標(biāo)記。該標(biāo)記通過獨(dú)特的引物設(shè)計(jì)對(duì)開放閱讀框（ORFs）進(jìn)行擴(kuò)增，可因個(gè)體不同以及物種的內(nèi)含子、啟動(dòng)子與間隔區(qū)長(zhǎng)度不等而產(chǎn)生多態(tài)性的擴(kuò)增產(chǎn)物，具有簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、在基因組中分布均勻等特點(diǎn)。本研究應(yīng)用SRAP技術(shù)對(duì)源自各地的32個(gè)茯苓栽培菌株進(jìn)行DNA指紋分析，以確定它們的親緣關(guān)系，清除種質(zhì)資源庫(kù)中同種異名、同名異種的菌株，并篩選出特異性標(biāo)記帶，為茯苓菌株的鑒定與選育提供分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

（1）菌株。32個(gè)茯苓栽培菌株源自不同地區(qū)（表1），由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所保藏并提供。

（2）試劑。PCR試劑盒及其他試劑均購(gòu)自上海生工生物工程服務(wù)有限公司。

（3）引物。本研究所用SRAP上游引物和下游引物均參照Li和Quiros[1]，由華大基因上海鼎安生物科技有限公司合成。

1.2 試驗(yàn)方法

（1）菌絲的培養(yǎng)。菌種接入常規(guī)PDA斜面培養(yǎng)基，25 ℃下培養(yǎng)14天。

（2）基因組DNA的提取。刮取適量斜面培養(yǎng)基上的菌絲，—70 ℃冰凍后砸碎，移入750 μL預(yù)冷的抽提緩沖液（100 mmol/L Tris-Cl，pH 8.0；50 mmol/L EDTA；500 mmol/L NaCl；20 mmol/L NaHSO3）中，旋渦振蕩。加入100 μL 10% SDS，顛倒混勻，在65 ℃下保溫15 min，加入250 μL5 mol/L KOAc，再次混合均勻，冰上放置20 min。16 000 r/min離心5 min后，上清液用酚/氯仿抽提1次。再次同樣離心后，于上清液中加0.7倍體積的異丙醇，室溫沉淀10 min。離心收集沉淀，用70%乙醇洗1遍，吹干后溶于20 μL TE（含17 μg/mL RNaseA）中，通過瓊脂糖凝膠電泳檢查總DNA質(zhì)量并定量后，置于—20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 供試茯苓菌株

（3）SRAP分析。根據(jù)文獻(xiàn)[1]中所述方法進(jìn)行SRAP擴(kuò)增，擴(kuò)增條帶以NTSYSpc-2.02j軟件進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 32個(gè)茯苓菌株的SRAP指紋圖譜分析

先用不同類型的少數(shù)菌株進(jìn)行SRAP引物對(duì)的篩選，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)me1-em5、me1-em7、me2-em4、me2-em6、me3-em10、me5-em9、me5-em10、me7-em6、me7-em8、me9-em16等 10對(duì)引物能產(chǎn)生較佳帶型并具有較好的重復(fù)性（SRAP引物序列見表2）。用這10對(duì)引物進(jìn)行SRAP分析，共擴(kuò)增出 23條穩(wěn)定標(biāo)記條帶，部分?jǐn)U增結(jié)果見圖1～4。

2.2 32個(gè)茯苓菌株DNA標(biāo)記條帶統(tǒng)計(jì)及聚類分析

表2 SRAP引物

圖1 32個(gè)茯苓菌株的SRAP擴(kuò)增圖譜(引物對(duì)me1-em5)

圖2 32個(gè)茯苓菌株的SRAP擴(kuò)增圖譜(引物對(duì)me1-em7)

將SRAP分子標(biāo)記擴(kuò)增獲得的23條特異條帶轉(zhuǎn)化成（1，0）數(shù)據(jù)表（擴(kuò)增陽(yáng)性記錄為“1”，擴(kuò)增陰性記錄為“0”），使用NTSYSpc-2.02j軟件對(duì)（1，0）數(shù)據(jù)表進(jìn)行分析和聚類，得到 32個(gè)菌株的親緣關(guān)系樹狀圖（圖5）。

圖3 32個(gè)茯苓菌株的SRAP擴(kuò)增圖譜(引物對(duì)me2-em4)

圖4 32個(gè)茯苓菌株的SRAP擴(kuò)增圖譜(引物對(duì)me9-em16)

圖5 32個(gè)茯苓菌株的親緣關(guān)系樹狀圖

通過對(duì)32個(gè)茯苓菌株進(jìn)行SRAP聚類分析，結(jié)果供試的菌株在 0.38的相似值上可以分為兩個(gè)大的類群，其中菌株P(guān)6285單獨(dú)聚為一類；其余的31個(gè)菌株聚為一類。這31個(gè)菌株在0.76的相似值又可分為3個(gè)亞類群，其中川杰1號(hào)-A5、閩苓、鄂苓1號(hào)、茯苓Y1、貴習(xí)茯苓、同仁堂1號(hào)、岳西茯苓、茯苓DB等8個(gè)菌株聚在一起；合肥茯苓、茯苓5.78、河南茯苓3個(gè)菌株聚為一類，其余20個(gè)菌株聚為一個(gè)類群。供試的32個(gè)菌株中有28個(gè)菌株可以通過這組引物得以區(qū)分。

3 討 論

從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，菌株P(guān)6283的DNA帶型較為獨(dú)特，在聚類中單獨(dú)聚為一類。結(jié)合該菌株的生物學(xué)特性分析，該菌株可能為茯苓屬的其他種，或是在該菌株的保藏過程中污染了其他的雜菌。菌株川杰1號(hào)-A5和閩苓無(wú)法通過這23個(gè)標(biāo)記分開，可能原因是閩苓是川杰1號(hào)-A5的直接誘變親本，親緣關(guān)系較近而無(wú)法通過這組SRAP標(biāo)記找到差異，但我們之前使用RAPD標(biāo)記技術(shù)卻可以較好地區(qū)分這兩個(gè)菌株[2]。菌株華中茯苓和W80694也無(wú)法通過這些SRAP標(biāo)記分開，可能為同種異名，或需要更多的標(biāo)記來(lái)區(qū)分。另從聚類結(jié)果也可以看出，供試的 32個(gè)菌株，除菌株P(guān)6283外，其他的菌株整體差異不大，雖然源自不同地區(qū)，但遺傳相似系數(shù)較高，表明所保藏的茯苓菌株整體遺傳背景較窄。這也與我們之前的研究以及曲直等應(yīng)用RAPD技術(shù)對(duì)茯苓種質(zhì)資源的研究結(jié)果較為一致[2,3]。

食用菌的分類目前多以生物學(xué)特性和農(nóng)藝性狀為主要依據(jù)，其結(jié)果易受主觀和客觀因素的影響。利用DNA分子指紋可以從遺傳本質(zhì)上對(duì)試驗(yàn)的菌株進(jìn)行比較，是近年來(lái)用以區(qū)分不同品種（菌株）的比較流行并可靠的手段[4～8]。本研究利用比較SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)所保藏的茯苓種質(zhì)資源進(jìn)行親緣關(guān)系評(píng)價(jià)，這些菌株涵蓋了國(guó)內(nèi)的大部分主要栽培品種。試驗(yàn)結(jié)果表明，供試的主要栽培品種間整體親緣關(guān)系較近，遺傳背景單一；也間接反映了國(guó)內(nèi)的茯苓種質(zhì)資源的整體情況。故在今后的遺傳育種中，引入新的野生種質(zhì)或是引進(jìn)國(guó)外的優(yōu)良基因?qū)蜍邇?yōu)良品種的選育是非常重要的。同時(shí)本研究也為茯苓品種分類鑒定和遺傳育種的親本選擇提供了分子依據(jù)。

[1]Li G, Quiros CF.Sequence-related amplified polymorphism(SRAP), a mew marker system based on a simple PCR rea-ction: its application to mapping and gene tagging in Brass-ica[J]. Theor Apple Genet, 2001, (103): 455-461.

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