楊 開 薛介豐 金月忠 張安強 孫培龍

（浙江工業(yè)大學生物與環(huán)境工程學院，杭州 310032）

松木層孔菌（Phellinus pini）又名松針層孔菌、松白腐菌，隸屬于擔子菌門、傘菌綱，銹革孔菌目（Hymenochaetales），銹革孔菌科（Hymenochaetaceae），木層孔菌屬（Phellinus）。松木層孔菌子實體多糖具有較顯著的抗病毒活性[1]，其菌絲體多糖對小鼠離體淋巴細胞也有較顯著的促增殖作用[2]。在松木層孔菌多糖抗氧化方面，王穩(wěn)航等人對三種子實體多糖進行了清除超氧陰離子、羥基自由基和丙二醛抑制的體外實驗[6]及小鼠體內抗氧化研究[7]。另外還有少數的酚類[8]和萜類[9]等成分的報道。

但與同屬的桑黃(Phellinus linteus)相比，目前有關松木層孔菌的研究還很少，也未見對其子實體多糖的提取工藝研究報道。本文以松木層孔菌子實體為原料優(yōu)化多糖微波輔助提取工藝，并研究體外抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性。這不僅為松木層孔菌多糖的提取生產提供工藝條件，而且也為該珍稀藥用菌的醫(yī)藥保健品研發(fā)提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 儀器與材料

儀器及生產廠家：MAS-Ⅱ微波萃取儀，上海新儀微波化學科技有限公司；SHB-Ⅱ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司；RE-2000A旋轉蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；UV-2550紫外可見分光光度計，日本島津公司；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；FW135中草藥粉碎機，上海將來實驗設備有限公司；Alpha 2-4 LD Plus真空冷凍干燥機，德國Christ公司；Spectra max M2多功能酶標儀，美國Molecular Devices公司。

松木層孔菌子實體：采自黑龍江，浙江益圣菌物發(fā)展有限公司提供，由浙江省醫(yī)學科學院保健食品研究所吳學謙研究員鑒定。

2,2-Diphenyl-picrylhydrazyl (DPPH)，2,2-Azin-obis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diam-monium salt (ABTS)，2,4,6-Tris (2-pyridyl)-striazi-ne (TPTZ)，α-葡萄糖苷酶(Saccharomyces cerevisi-ae)，4-nitrophenyl-alpha-D-glucopyranosidide (PNP-G)購自Sigma公司；其余試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 實驗方法

松木層孔菌子實體切成小塊后粉碎機粉碎，過60目篩，潔凈PE袋雙層密封后室溫干燥貯藏備用。

1.2.1 粗多糖提取流程。松木層孔菌子實體粉末60 ℃烘干至恒重，稱取10 g左右倒入1 L的玻璃燒瓶中，按比例加入水，設置相應溫度后微波攪拌提取一定時間，5 000 r/min離心后取上清液，真空濃縮至原有體積的1/5左右后加入4倍體積95%食用級乙醇輕微攪拌后沉淀，靜置8 h以上，得醇沉物。醇沉物再經無水乙醇、丙酮洗滌，72 h冷凍干燥后得松木層孔菌粗多糖。

1.2.2 響應面實驗設計。 綜合相關文獻報道以及前期預試結果，本論文固定微波提取功率為600 W，設定料液比（A）、提取時間（B）和提取溫度（C）為 3個主要影響因素，以總多糖提取率（Y）為評價指標進行響應面 Box-Behnken實驗設計，因素水平見表1。

表1 響應面設計及實驗結果

1.2.3 多糖提取率測定。多糖含量采用苯酚-硫酸法[10]測定，平行3次測定，再按以下公式計算提取率。

1.2.4 抗氧化活性測定?；诓煌目寡趸恚鞣N體外抗氧化活性檢測方法很多，目前常用的抗氧化活性檢測方法主要是基于自由基清除能力、抑制脂類氧化能力和樣品還原能力三種機理[11]。由于樣品體系的多樣性和復雜性，目前還尚未有統(tǒng)一的方法，而且每種方法存在一定的優(yōu)缺點和局限性，所以一般要通過兩種以上的抗氧化方法來評價樣品的抗氧化性能[12]。本文采用了文獻[6]以外的DPPH、ABTS和FRAP三種常用方法來評價松木層孔菌粗多糖的抗氧化活性。

（1）清除 DPPH自由基活性測定。測定方法參考Milardovic[13]的報道并略有改動。用80%甲醇溶液配制成0.2 mmol/L的DPPH試劑，取1 mL稀釋的提取液與3 mL DPPH試劑混合，暗處反應1 h，然后在515 nm下測定吸光值。以80%甲醇溶液作為空白對照。其結果表達為清除率達到50%時所對應的多糖濃度（即EC50）。

其中，A0為空白對照的吸光值；A1為樣品的吸光值。下同。

（2）清除 ABTS自由基活性測定。測定方法參考 Miller[14]的報道并略作修改。取 140 mmol/L的過硫酸鉀溶液加入到 7 mmol/L的ABTS溶液中混合，暗處反應12～16 h。測定前用無水乙醇將ABTS·+溶液稀釋至吸光值為0.70 ±0.02（734 nm下）。取0.2 mL稀釋過的提取液與3.8 mL的 ABTS·+溶液混合搖勻，在室溫下反應10 min后，在734 nm下測定吸光值。以80%甲醇溶液作為空白對照。其結果表達為清除率達到50%時所對應的多糖濃度（即EC50）。

（3）FRAP總抗氧化活性測定。測定方法參考Benzie[15]的報道并略有修改。FRAP試劑的準備：將 0.1 mol/L的醋酸緩沖試劑（pH3.6）、19 mmol/L 的TPTZ、20 mmol/L氯化鐵，按體積比10︰1︰1混合。3.9 mL FRAP試劑工作液加入0.1 mL稀釋過的提取液，混合均勻，置于37 ℃恒溫水浴中10 min，然后在593 nm下測其吸光值。以 FeSO4為標準溶液，根據反應后的吸光值，在標準曲線上求得相應的FeSO4濃度，定義為FRAP值，結果以每毫克多糖相當FeSO4還原力的相當量表示（mmol FeSO4/mg多糖），F(xiàn)RAP值愈大，抗氧化活性愈強。

1.2.5 α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定。測定方法參考 Dong[16]的報道并略作修改。將 α-葡萄糖苷酶溶于pH 6.8、0.1 mol/L磷酸緩沖液配成1 U/mL酶液，PNPG溶于相同緩沖液配成5 mmol/L底物液，整個檢測在96微孔板上進行。取60 μL樣品、50 μL酶液在37 ℃下保溫10 min，再加入5 mmol/L PNPG 反應 20 min，用 160 μL 0.2 M Na2CO3終止酶反應。最后在酶標儀上405 nm處測定吸光值，以磷酸緩沖液作為空白對照。其結果表達為抑制率達到 50%時所對應的多糖濃度（即IC50）。

其中，Asample為樣品的吸光值；Asampleblack為無底物時樣品的吸光值；Acontrol為空白的吸光值；Acontrolblack為無底物時空白的吸光值。

1.3 數據處理

實驗時平行3次測定，測定結果以均值±標準差（Means±SD）表示。實驗數據采用SPSS16.0的ANOVA進行鄧肯氏（Duncan’s）差異分析，以P＜0.05為顯著。

2 結果與分析

2.1 響應面優(yōu)化多糖提取工藝

根據Box-Behnken的中心組合設計原理，以松木層孔菌的多糖提取率為響應值，通過響應面分析對提取條件進行優(yōu)化，實驗結果見表1。

利用Design-Expert 8軟件對表1中的實驗數據進行回歸擬合，其分析結果見表2、表3?；貧w方差分析表明，該模型極顯著（P＜0.0001），模型的R2=0.9749，AdjR2=0.9427，說明模型的擬合程度較好，可用于松木層孔菌多糖提取工藝實驗的預測。

利用軟件對實驗數據進行擬合，得到多糖提取率 Y（%）對 A:料液比（液體量）、B:提取溫度（℃）、C:提取時間（min）的回歸方程如下：

表2 方差分析

表3 回歸方程系數顯著性檢驗

2.2 各因素間的交互作用

根據上述的回歸分析結果，采用軟件Design-Expert 8對回歸方程分析作響應面，生成相應的響應曲面圖及其等高線圖，以確定料液比、提取時間、提取溫度3個因素對多糖提取率的影響，結果如圖 1～3所示，結合方差分析結果表明：FA=10.79，F(xiàn)B=128.06，F(xiàn)C=21.65，各因素的F值越大，則說明該因素對實驗指標的影響愈大，即重要性愈大。由此可見，各因素對松木層孔菌多糖提取率的影響程度大小為：B（提取溫度）＞C（提取時間）＞A（料液比）。

2.3 最佳工藝條件的確定及驗證實驗

為進一步確定最佳點，通過Design-Expert 8軟件求解多糖提取率的最大值，得到松木層孔菌多糖提取的最佳條件為：料液比1︰39.92，提取溫度91.85 ℃，提取時間59.88 min，預測多糖的提取率達到 3.46 %。為檢驗響應面模型的可靠性，同時考慮到實際操作的便利，綜合確定最佳條件為：料液比為1︰40，提取溫度為92 ℃，提取時間為60 min。在此條件下3次平均的多糖提取率為 3.33%，與理論值的誤差為 3.76%，理論值與實際值基本相符。因此，響應面法所得的優(yōu)化提取工藝參數較準確，具有較好的參考價值。

圖1 料液比與提取溫度對多糖提取率影響的等高線圖和響應面圖

圖2 料液比與提取時間對多糖提取率影響的等高線圖和響應面圖

圖3 提取溫度與提取時間對多糖提取率影響的等高線圖和響應面圖

2.4 提取次數實驗

根據以上最佳提取條件，進行了提取次數對多糖得率的影響實驗，前次提取所得濾渣進行下一次提取，共進行了3次提?。ㄖ貜?次），單次提取率分別是 3.33±0.16%、0.55±0.17%、0.21±0.01%。其中，第1次提取時多糖平均提取率可達3.33%，第2次降為0.55%，第3次僅為0.21%，按3次總和計算，有94.8%的多糖在前2次就可提取完全，為減少后期蒸發(fā)濃縮和超濾等操作，提取次數以2次為宜。

2.5 體外活性測定結果

松木層孔菌多糖體外抗氧化和 α-葡萄糖苷酶抑制活性測定結果見表4。

表4 松木層孔菌多糖抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性結果

發(fā)現(xiàn)在實驗的濃度范圍內，松木層孔菌多糖對 DPPH?和 ABTS·+自由基的清除率均隨濃度增加而增加，呈量效關系，對DPPH?自由基的半清除濃度（EC50）為 2.59 mg/mL，高于雞油菌[17]粗多糖清除DPPH?的EC50值（0.92 mg/mL）；對ABTS·+自由基的半清除濃度（EC50）為 6.44 mg/mL，高于DPPH的EC50值，也高于尖頂羊肚菌[18]胞外多糖提取物的清除 ABTS·+值；反映總抗氧化能力的FRAP值為0.27 mmol FeSO4/mg多糖。對α-葡萄糖苷酶活性的抑制實驗結果表明，在一定的多糖濃度范圍內，該多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用也呈量效應關系，半抑制濃度（IC50）為2.17 mg/mL，其效果要低于同屬的樺褐孔菌多糖[19]，而優(yōu)于陽性對照阿卡波糖（IC50=4.26 mg/mL）。

3 討 論

本文采用微波輔助提取松木層孔菌子實體多糖，Box-Behnken響應面實驗優(yōu)化多糖提取工藝，影響松木層孔菌多糖提取率的因素依次為：提取溫度＞提取時間＞料液比，綜合確定的優(yōu)化提取工藝條件為：微波功率600 W，料液比1︰40，提取溫度92 ℃，提取時間60 min。經80%乙醇沉淀，二次提取，在此條件下松木層孔菌的多糖累計提取率為3.88%。

采用DPPH、ABTS、FRAP三種方法測定松木層孔菌多糖的體外抗氧化活性，結果表明，松木層孔菌粗多糖具有一定的抗氧化活性，有待對其中具抗氧化活性的多糖結構進行更深入的純化及鑒定等研究。該多糖還顯示了一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性，可能具有潛在降血糖功能，需作構效關系研究予以證實。

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