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        豬苓對LPS誘導(dǎo)的J774細(xì)胞IL-6與iNOS表達(dá)的影響

        2013-05-29 06:19:50胡金萍江澤波
        當(dāng)代醫(yī)學(xué) 2013年6期
        關(guān)鍵詞:豬苓空白對照多糖

        胡金萍 江澤波

        中藥豬苓為一種藥用真菌,味甘淡,性平,目前已廣泛用于腫瘤治療的輔助藥物[1-2]。對豬苓免疫作用的研究主要集中在其有效成分——豬苓多糖(PPS)上,研究表明,豬苓多糖具有多種藥理功效,特別是在提高免疫功能及抗腫瘤方面作用顯著[3]。近年來對豬苓的減毒增效機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)[4],與PPS相比,豬苓復(fù)方在提高機(jī)體疫功能的同時還能避免PPS直接給藥帶來的副作用,這可能與豬苓中含有多種有效成分相互拮抗作用相關(guān)。本研究以J 774細(xì)胞為載體,觀察豬苓對J 774 細(xì)胞分泌(IL-6)、iNOS的影響,探討其免疫調(diào)節(jié)作用。

        1 資料與方法

        1.1 主要試劑與儀器

        1.1.1 細(xì)胞 J 774 細(xì)胞株為廣東省中醫(yī)院中心實驗室提供。

        1.1.2 藥物 豬苓顆粒(江陰天江藥業(yè),500 mg/袋,相當(dāng)于飲片10 g,產(chǎn)品批號:1108049)。

        1.1.3 主要試劑及儀器 DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(Hyclone);LPS(055:B 5,Sigma);MTT(Sigma);TRizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(Invitrogen);氯仿、異丙醇、二甲基亞砜(廣州化學(xué)試劑廠);UV-2450 紫外分光光度計(日本島津);二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(Thermo);全自動酶標(biāo)儀(BIORAD);實時熒光定量基因擴(kuò)增系統(tǒng)(ABI,7500 型);超速冷凍離心機(jī)(Beckman);超凈工作臺(ESCO)。

        1.2 方法

        1.2.1 J 774 細(xì)胞的培養(yǎng) 細(xì)胞用含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng),待融合度達(dá)80%時,棄去培養(yǎng)液,胰酶消化傳代,按需分入新瓶中,2~3 d換液一次。

        1.2.2 豬苓對J 774 細(xì)胞活力的影響

        1.2.2.1 細(xì)胞分組 取對數(shù)生長期細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個/mL,100 μL/孔接種到96 孔培養(yǎng)板中,細(xì)胞分為空白對照組和豬苓給藥組(終濃度分別為0.05、0.5、5、50、100、250 μg/mL),每組6 個復(fù)孔。

        1.2.2.2 MTT法檢測豬苓對J 774 細(xì)胞活力的影響 待細(xì)胞貼壁后,吸棄上清,按上述分組給藥,每孔終體積為0.2 mL。37℃,5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)24 h后,加入MTT(5 mg/mL)溶液20 μL/孔,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄上清,每孔加入150 μL DMSO,置搖床上低速震蕩10 min使結(jié)晶物充分溶解,于OD570處測量每孔吸光值。

        1.2.3 豬苓對LPS誘導(dǎo)的J 774 細(xì)胞IL-6、iNOS mRNA表達(dá)的影響

        1.2.3.1 細(xì)胞分組 取對數(shù)生長期細(xì)胞,接種至6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,將細(xì)胞分為空白對照組,LPS模型組(終濃度10 μg/mL),豬苓給藥組(終濃度0.5、5、50 μg/mL)。待細(xì)胞貼壁后,先加入LPS作用2 h,后給予各濃度豬苓,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,空白對照組給予相同體積培養(yǎng)基。

        1.2.3.2 引物設(shè)計 引物由Invitrogen公司合成,GAPDH上游序列5′-GTTTTCAGGGATGAAGCGGC-3′,下游序列5′-TTTGTCAAGCTCATTTCCTGGTATG-3′;IL-6上游序列5′-GTCTTGGCCGAGGACTAAGG-3′,下游序列5′-TACTCGGCAAACCTAGTGCG-3′;iNOS上游序列5′-TGAGTTCCGAAGCAAGCCAA-3′,下游序列5′- AGACCTCAACAGAGCCCTCA-3′。

        1.2.3.3 熒光定量PCR法檢測IL-6、iNOS mRNA的表達(dá) 藥物處理24 h后按照Trizol reagent說明書提取各組細(xì)胞總RNA,進(jìn)行濃度、純度和完整性檢測后,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA為模板擴(kuò)增IL-6,iNOS的基因編碼片段,各組分主要如下:SYBR Green 10 μL、10 μmol/L的上下游引物各1 μL、cDNA模板10 μL、DEPC水12 μL,反應(yīng)體系為50 μL,擴(kuò)增條件:50℃2 min,95℃2 min,95℃15 s,60℃34 s,45 個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參,采用2-△△CT法計算相對基因表達(dá)。

        圖1 豬苓對J774細(xì)胞活力的影響

        圖2 豬苓對LPS誘導(dǎo)的J 774 細(xì)胞 IL-6、iNOS mRNA表達(dá)的影響

        2 結(jié)果

        2.1 豬苓對J 774 細(xì)胞活力的影響 與空白對照組相比,在0.5~50 μg/mL劑量范圍內(nèi),細(xì)胞存活率與空白組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),說明在此劑量范圍內(nèi)的豬苓對J 774 細(xì)胞無毒性作用,為排除后續(xù)實驗中豬苓對IL-6 及iNOS的影響與其細(xì)胞毒作用相關(guān),故在此無細(xì)胞毒劑量范圍內(nèi)選取3 個濃度進(jìn)行后續(xù)實驗。見圖1。

        2.2 豬苓對LPS誘導(dǎo)的J 774 細(xì)胞IL-6、iNOS mRNA表達(dá)的影響 由數(shù)據(jù)分析可見,經(jīng)LPS誘導(dǎo)后,IL-6、iNOS mRNA的表達(dá)量顯著上升,與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);加入不同濃度豬苓之后,能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)的IL-6、iNOS mRNA的表達(dá),并且隨著豬苓劑量的增大,其抑制作用越強(qiáng),具有明顯的量效關(guān)系,各豬苓給藥組與LPS模型組相比,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

        3 討論

        巨噬細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中一類特殊的效應(yīng)細(xì)胞,參與機(jī)體的各種炎癥和免疫應(yīng)答過程,LPS為機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的主要誘導(dǎo)因素之一,巨噬細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后,可釋放多種炎癥因子參與炎癥反應(yīng),當(dāng)炎癥因子過度表達(dá)則會觸發(fā)機(jī)體內(nèi)炎癥瀑布反應(yīng),可引起全身炎癥反應(yīng)綜合征。IL-6 是一類十分重要的前炎癥因子,由單核巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌,具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng),可作用于多種靶細(xì)胞而參與免疫和炎癥過程,應(yīng)對包括LPS在內(nèi)的各種炎性刺激及胞外應(yīng)激信號,是炎性瀑布過程中的關(guān)鍵因子,IL-6 在組織內(nèi)過度升高可以引起組織的病理損傷,很多研究表明IL-6 聚集度與局部炎性程度正相關(guān)。iNOS由炎癥因子、LPS等誘導(dǎo),iNOS表達(dá)上調(diào)可導(dǎo)致其介導(dǎo)的炎癥因子NO濃度升高,高濃度的NO會導(dǎo)致組織損傷,調(diào)節(jié)NO的生成及iNOS的表達(dá)被認(rèn)為是治療炎癥疾病的重要手段。綜上所述,IL-6、iNOS的表達(dá)變化對組織內(nèi)環(huán)境影響重大。在本室既往研究中發(fā)現(xiàn),豬苓及豬苓多糖可協(xié)同卡介苗調(diào)節(jié)膀胱癌大鼠腹腔巨噬細(xì)胞表面分子的表達(dá)并降低腹腔巨噬細(xì)胞NO的釋放,進(jìn)而調(diào)節(jié)膀胱癌大鼠腹腔巨噬細(xì)胞的功能,降低NO過度釋放對機(jī)體組織的損傷作用[5]。在本實驗中,豬苓呈濃度依賴性抑制LPS誘導(dǎo)的J 774 細(xì)胞IL-6、iNOS的表達(dá),推測IL-6 表達(dá)的降低可能是通過下調(diào)iNOS的表達(dá),從而抑制炎癥介子NO的釋放,達(dá)到抑制炎癥因子及炎癥反應(yīng)的作用。豬苓含有多種組成成分,其抗炎功效的具體有效成分,以及其保護(hù)作用是否涉及其他的分子作用機(jī)制,還有待繼續(xù)研究。

        [1]中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:222.

        [2]肖建輝,梁宗琦,劉愛英.蟲草無性型及其相關(guān)真菌多糖的研究開發(fā)現(xiàn)狀[J].藥學(xué)學(xué)報,2002,37(7):589-592.

        [3]劉洪超,楊小龍,王淑英.豬苓藥理作用研究進(jìn)展[J].河南科技大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2011,29(2):159-160.

        [4]曾星,李彩霞,黃羽,等.豬苓及豬苓多糖對膀胱癌模型大鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬和表面相關(guān)分子表達(dá)的影響[J].中國免疫學(xué)雜志,2011,27(5):414-418.

        [5]李彩霞,曾星,黃羽,等.豬苓及豬苓多糖協(xié)同卡介苗對膀胱癌大鼠模型腹腔巨噬細(xì)胞功能的影響[J].中國免疫學(xué)雜志,2011,27(6):514-517.

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