胡金萍 江澤波

中藥豬苓為一種藥用真菌，味甘淡，性平，目前已廣泛用于腫瘤治療的輔助藥物[1-2]。對豬苓免疫作用的研究主要集中在其有效成分——豬苓多糖(PPS)上，研究表明，豬苓多糖具有多種藥理功效，特別是在提高免疫功能及抗腫瘤方面作用顯著[3]。近年來對豬苓的減毒增效機制研究發(fā)現[4]，與PPS相比，豬苓復方在提高機體疫功能的同時還能避免PPS直接給藥帶來的副作用，這可能與豬苓中含有多種有效成分相互拮抗作用相關。本研究以J 774細胞為載體，觀察豬苓對J 774 細胞分泌(IL-6)、iNOS的影響，探討其免疫調節(jié)作用。

1 資料與方法

1.1 主要試劑與儀器

1.1.1 細胞 J 774 細胞株為廣東省中醫(yī)院中心實驗室提供。

1.1.2 藥物 豬苓顆粒（江陰天江藥業(yè)，500 mg/袋，相當于飲片10 g，產品批號：1108049）。

1.1.3 主要試劑及儀器 DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（Hyclone）；LPS（055：B 5，Sigma）；MTT（Sigma）；TRizol、逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒（Invitrogen）；氯仿、異丙醇、二甲基亞砜（廣州化學試劑廠）；UV-2450 紫外分光光度計（日本島津）；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（Thermo）；全自動酶標儀（BIORAD）；實時熒光定量基因擴增系統（ABI，7500 型）；超速冷凍離心機（Beckman）；超凈工作臺（ESCO）。

1.2 方法

1.2.1 J 774 細胞的培養(yǎng) 細胞用含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，待融合度達80%時，棄去培養(yǎng)液，胰酶消化傳代，按需分入新瓶中，2～3 d換液一次。

1.2.2 豬苓對J 774 細胞活力的影響

1.2.2.1 細胞分組 取對數生長期細胞，調整細胞濃度為5×104個/mL，100 μL/孔接種到96 孔培養(yǎng)板中，細胞分為空白對照組和豬苓給藥組（終濃度分別為0.05、0.5、5、50、100、250 μg/mL），每組6 個復孔。

1.2.2.2 MTT法檢測豬苓對J 774 細胞活力的影響 待細胞貼壁后，吸棄上清，按上述分組給藥，每孔終體積為0.2 mL。37℃，5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)24 h后，加入MTT（5 mg/mL）溶液20 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，置搖床上低速震蕩10 min使結晶物充分溶解，于OD570處測量每孔吸光值。

1.2.3 豬苓對LPS誘導的J 774 細胞IL-6、iNOS mRNA表達的影響

1.2.3.1 細胞分組 取對數生長期細胞，接種至6 孔細胞培養(yǎng)板中，將細胞分為空白對照組，LPS模型組（終濃度10 μg/mL），豬苓給藥組（終濃度0.5、5、50 μg/mL）。待細胞貼壁后，先加入LPS作用2 h，后給予各濃度豬苓,繼續(xù)培養(yǎng)24 h，空白對照組給予相同體積培養(yǎng)基。

1.2.3.2 引物設計 引物由Invitrogen公司合成，GAPDH上游序列5′-GTTTTCAGGGATGAAGCGGC-3′，下游序列5′-TTTGTCAAGCTCATTTCCTGGTATG-3′；IL-6上游序列5′-GTCTTGGCCGAGGACTAAGG-3′，下游序列5′-TACTCGGCAAACCTAGTGCG-3′；iNOS上游序列5′-TGAGTTCCGAAGCAAGCCAA-3′，下游序列5′- AGACCTCAACAGAGCCCTCA-3′。

1.2.3.3 熒光定量PCR法檢測IL-6、iNOS mRNA的表達 藥物處理24 h后按照Trizol reagent說明書提取各組細胞總RNA，進行濃度、純度和完整性檢測后，按照逆轉錄試劑盒說明書將mRNA逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板擴增IL-6，iNOS的基因編碼片段，各組分主要如下：SYBR Green 10 μL、10 μmol/L的上下游引物各1 μL、cDNA模板10 μL、DEPC水12 μL，反應體系為50 μL，擴增條件：50℃2 min，95℃2 min，95℃15 s，60℃34 s，45 個循環(huán)。以GAPDH為內參，采用2-△△CT法計算相對基因表達。

圖1 豬苓對J774細胞活力的影響

圖2 豬苓對LPS誘導的J 774 細胞 IL-6、iNOS mRNA表達的影響

2 結果

2.1 豬苓對J 774 細胞活力的影響 與空白對照組相比，在0.5～50 μg/mL劑量范圍內，細胞存活率與空白組比較差異無統計學意義（P＞0.05），說明在此劑量范圍內的豬苓對J 774 細胞無毒性作用，為排除后續(xù)實驗中豬苓對IL-6 及iNOS的影響與其細胞毒作用相關，故在此無細胞毒劑量范圍內選取3 個濃度進行后續(xù)實驗。見圖1。

2.2 豬苓對LPS誘導的J 774 細胞IL-6、iNOS mRNA表達的影響 由數據分析可見，經LPS誘導后，IL-6、iNOS mRNA的表達量顯著上升,與空白對照組相比差異有統計學意義（P＜0.01）；加入不同濃度豬苓之后，能夠顯著抑制LPS誘導的IL-6、iNOS mRNA的表達，并且隨著豬苓劑量的增大，其抑制作用越強，具有明顯的量效關系，各豬苓給藥組與LPS模型組相比，差異均具有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

3 討論

巨噬細胞是免疫系統中一類特殊的效應細胞，參與機體的各種炎癥和免疫應答過程，LPS為機體產生炎癥反應的主要誘導因素之一，巨噬細胞經LPS刺激后，可釋放多種炎癥因子參與炎癥反應，當炎癥因子過度表達則會觸發(fā)機體內炎癥瀑布反應，可引起全身炎癥反應綜合征。IL-6 是一類十分重要的前炎癥因子，由單核巨噬細胞、T淋巴細胞等多種細胞分泌，具有廣泛的生物學效應，可作用于多種靶細胞而參與免疫和炎癥過程，應對包括LPS在內的各種炎性刺激及胞外應激信號，是炎性瀑布過程中的關鍵因子，IL-6 在組織內過度升高可以引起組織的病理損傷，很多研究表明IL-6 聚集度與局部炎性程度正相關。iNOS由炎癥因子、LPS等誘導，iNOS表達上調可導致其介導的炎癥因子NO濃度升高，高濃度的NO會導致組織損傷，調節(jié)NO的生成及iNOS的表達被認為是治療炎癥疾病的重要手段。綜上所述，IL-6、iNOS的表達變化對組織內環(huán)境影響重大。在本室既往研究中發(fā)現，豬苓及豬苓多糖可協同卡介苗調節(jié)膀胱癌大鼠腹腔巨噬細胞表面分子的表達并降低腹腔巨噬細胞NO的釋放，進而調節(jié)膀胱癌大鼠腹腔巨噬細胞的功能，降低NO過度釋放對機體組織的損傷作用[5]。在本實驗中，豬苓呈濃度依賴性抑制LPS誘導的J 774 細胞IL-6、iNOS的表達，推測IL-6 表達的降低可能是通過下調iNOS的表達，從而抑制炎癥介子NO的釋放，達到抑制炎癥因子及炎癥反應的作用。豬苓含有多種組成成分，其抗炎功效的具體有效成分，以及其保護作用是否涉及其他的分子作用機制，還有待繼續(xù)研究。

[1]中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京：化學工業(yè)出版社，2005：222.

[2]肖建輝，梁宗琦，劉愛英.蟲草無性型及其相關真菌多糖的研究開發(fā)現狀[J].藥學學報，2002，37（7）：589-592.

[3]劉洪超，楊小龍，王淑英.豬苓藥理作用研究進展[J].河南科技大學學報：醫(yī)學版，2011，29（2）：159-160.

[4]曾星，李彩霞，黃羽，等.豬苓及豬苓多糖對膀胱癌模型大鼠腹腔巨噬細胞吞噬和表面相關分子表達的影響[J].中國免疫學雜志，2011，27（5）：414-418.

[5]李彩霞，曾星，黃羽，等.豬苓及豬苓多糖協同卡介苗對膀胱癌大鼠模型腹腔巨噬細胞功能的影響[J].中國免疫學雜志，2011，27（6）：514-517.