胡金萍 江澤波

中藥豬苓為一種藥用真菌，味甘淡，性平，目前已廣泛用于腫瘤治療的輔助藥物[1-2]。對(duì)豬苓免疫作用的研究主要集中在其有效成分——豬苓多糖(PPS)上，研究表明，豬苓多糖具有多種藥理功效，特別是在提高免疫功能及抗腫瘤方面作用顯著[3]。近年來對(duì)豬苓的減毒增效機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)[4]，與PPS相比，豬苓復(fù)方在提高機(jī)體疫功能的同時(shí)還能避免PPS直接給藥帶來的副作用，這可能與豬苓中含有多種有效成分相互拮抗作用相關(guān)。本研究以J 774細(xì)胞為載體，觀察豬苓對(duì)J 774 細(xì)胞分泌(IL-6)、iNOS的影響，探討其免疫調(diào)節(jié)作用。

1 資料與方法

1.1 主要試劑與儀器

1.1.1 細(xì)胞 J 774 細(xì)胞株為廣東省中醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 藥物 豬苓顆粒（江陰天江藥業(yè)，500 mg/袋，相當(dāng)于飲片10 g，產(chǎn)品批號(hào)：1108049）。

1.1.3 主要試劑及儀器 DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（Hyclone）；LPS（055：B 5，Sigma）；MTT（Sigma）；TRizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒（Invitrogen）；氯仿、異丙醇、二甲基亞砜（廣州化學(xué)試劑廠）；UV-2450 紫外分光光度計(jì)（日本島津）；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（Thermo）；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（BIORAD）；實(shí)時(shí)熒光定量基因擴(kuò)增系統(tǒng)（ABI，7500 型）；超速冷凍離心機(jī)（Beckman）；超凈工作臺(tái)（ESCO）。

1.2 方法

1.2.1 J 774 細(xì)胞的培養(yǎng) 細(xì)胞用含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，待融合度達(dá)80%時(shí)，棄去培養(yǎng)液，胰酶消化傳代，按需分入新瓶中，2～3 d換液一次。

1.2.2 豬苓對(duì)J 774 細(xì)胞活力的影響

1.2.2.1 細(xì)胞分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL，100 μL/孔接種到96 孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞分為空白對(duì)照組和豬苓給藥組（終濃度分別為0.05、0.5、5、50、100、250 μg/mL），每組6 個(gè)復(fù)孔。

1.2.2.2 MTT法檢測(cè)豬苓對(duì)J 774 細(xì)胞活力的影響 待細(xì)胞貼壁后，吸棄上清，按上述分組給藥，每孔終體積為0.2 mL。37℃，5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)24 h后，加入MTT（5 mg/mL）溶液20 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，置搖床上低速震蕩10 min使結(jié)晶物充分溶解，于OD570處測(cè)量每孔吸光值。

1.2.3 豬苓對(duì)LPS誘導(dǎo)的J 774 細(xì)胞IL-6、iNOS mRNA表達(dá)的影響

1.2.3.1 細(xì)胞分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種至6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，將細(xì)胞分為空白對(duì)照組，LPS模型組（終濃度10 μg/mL），豬苓給藥組（終濃度0.5、5、50 μg/mL）。待細(xì)胞貼壁后，先加入LPS作用2 h，后給予各濃度豬苓,繼續(xù)培養(yǎng)24 h，空白對(duì)照組給予相同體積培養(yǎng)基。

1.2.3.2 引物設(shè)計(jì) 引物由Invitrogen公司合成，GAPDH上游序列5′-GTTTTCAGGGATGAAGCGGC-3′，下游序列5′-TTTGTCAAGCTCATTTCCTGGTATG-3′；IL-6上游序列5′-GTCTTGGCCGAGGACTAAGG-3′，下游序列5′-TACTCGGCAAACCTAGTGCG-3′；iNOS上游序列5′-TGAGTTCCGAAGCAAGCCAA-3′，下游序列5′- AGACCTCAACAGAGCCCTCA-3′。

1.2.3.3 熒光定量PCR法檢測(cè)IL-6、iNOS mRNA的表達(dá) 藥物處理24 h后按照Trizol reagent說明書提取各組細(xì)胞總RNA，進(jìn)行濃度、純度和完整性檢測(cè)后，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板擴(kuò)增IL-6，iNOS的基因編碼片段，各組分主要如下：SYBR Green 10 μL、10 μmol/L的上下游引物各1 μL、cDNA模板10 μL、DEPC水12 μL，反應(yīng)體系為50 μL，擴(kuò)增條件：50℃2 min，95℃2 min，95℃15 s，60℃34 s，45 個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△CT法計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)。

圖1 豬苓對(duì)J774細(xì)胞活力的影響

圖2 豬苓對(duì)LPS誘導(dǎo)的J 774 細(xì)胞 IL-6、iNOS mRNA表達(dá)的影響

2 結(jié)果

2.1 豬苓對(duì)J 774 細(xì)胞活力的影響 與空白對(duì)照組相比，在0.5～50 μg/mL劑量范圍內(nèi)，細(xì)胞存活率與空白組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明在此劑量范圍內(nèi)的豬苓對(duì)J 774 細(xì)胞無毒性作用，為排除后續(xù)實(shí)驗(yàn)中豬苓對(duì)IL-6 及iNOS的影響與其細(xì)胞毒作用相關(guān)，故在此無細(xì)胞毒劑量范圍內(nèi)選取3 個(gè)濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖1。

2.2 豬苓對(duì)LPS誘導(dǎo)的J 774 細(xì)胞IL-6、iNOS mRNA表達(dá)的影響 由數(shù)據(jù)分析可見，經(jīng)LPS誘導(dǎo)后，IL-6、iNOS mRNA的表達(dá)量顯著上升,與空白對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；加入不同濃度豬苓之后，能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)的IL-6、iNOS mRNA的表達(dá)，并且隨著豬苓劑量的增大，其抑制作用越強(qiáng)，具有明顯的量效關(guān)系，各豬苓給藥組與LPS模型組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

3 討論

巨噬細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中一類特殊的效應(yīng)細(xì)胞，參與機(jī)體的各種炎癥和免疫應(yīng)答過程，LPS為機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的主要誘導(dǎo)因素之一，巨噬細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后，可釋放多種炎癥因子參與炎癥反應(yīng)，當(dāng)炎癥因子過度表達(dá)則會(huì)觸發(fā)機(jī)體內(nèi)炎癥瀑布反應(yīng)，可引起全身炎癥反應(yīng)綜合征。IL-6 是一類十分重要的前炎癥因子，由單核巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，可作用于多種靶細(xì)胞而參與免疫和炎癥過程，應(yīng)對(duì)包括LPS在內(nèi)的各種炎性刺激及胞外應(yīng)激信號(hào)，是炎性瀑布過程中的關(guān)鍵因子，IL-6 在組織內(nèi)過度升高可以引起組織的病理?yè)p傷，很多研究表明IL-6 聚集度與局部炎性程度正相關(guān)。iNOS由炎癥因子、LPS等誘導(dǎo)，iNOS表達(dá)上調(diào)可導(dǎo)致其介導(dǎo)的炎癥因子NO濃度升高，高濃度的NO會(huì)導(dǎo)致組織損傷，調(diào)節(jié)NO的生成及iNOS的表達(dá)被認(rèn)為是治療炎癥疾病的重要手段。綜上所述，IL-6、iNOS的表達(dá)變化對(duì)組織內(nèi)環(huán)境影響重大。在本室既往研究中發(fā)現(xiàn)，豬苓及豬苓多糖可協(xié)同卡介苗調(diào)節(jié)膀胱癌大鼠腹腔巨噬細(xì)胞表面分子的表達(dá)并降低腹腔巨噬細(xì)胞NO的釋放，進(jìn)而調(diào)節(jié)膀胱癌大鼠腹腔巨噬細(xì)胞的功能，降低NO過度釋放對(duì)機(jī)體組織的損傷作用[5]。在本實(shí)驗(yàn)中，豬苓呈濃度依賴性抑制LPS誘導(dǎo)的J 774 細(xì)胞IL-6、iNOS的表達(dá)，推測(cè)IL-6 表達(dá)的降低可能是通過下調(diào)iNOS的表達(dá)，從而抑制炎癥介子NO的釋放，達(dá)到抑制炎癥因子及炎癥反應(yīng)的作用。豬苓含有多種組成成分，其抗炎功效的具體有效成分，以及其保護(hù)作用是否涉及其他的分子作用機(jī)制，還有待繼續(xù)研究。

[1]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：222.

[2]肖建輝，梁宗琦，劉愛英.蟲草無性型及其相關(guān)真菌多糖的研究開發(fā)現(xiàn)狀[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2002，37（7）：589-592.

[3]劉洪超，楊小龍，王淑英.豬苓藥理作用研究進(jìn)展[J].河南科技大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2011，29（2）：159-160.

[4]曾星，李彩霞，黃羽，等.豬苓及豬苓多糖對(duì)膀胱癌模型大鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬和表面相關(guān)分子表達(dá)的影響[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志，2011，27（5）：414-418.

[5]李彩霞，曾星，黃羽，等.豬苓及豬苓多糖協(xié)同卡介苗對(duì)膀胱癌大鼠模型腹腔巨噬細(xì)胞功能的影響[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志，2011，27（6）：514-517.