張佳佳,巫 軍,林厚文

(1.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校,浙江寧波315200;2.寧波拜奧生物醫(yī)藥科技,浙江寧波315201;3.第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)征醫(yī)院藥學(xué)部,上海200003)

細(xì)薄星芒海綿(Stelletta tenuis Lindgren)屬尋常海綿綱(Demospongiae)、星骨海綿目(Astrophorida)、星芒海綿科(Stellettidae)星芒海綿屬(Stelletta)動(dòng)物,該物種在我國(guó)從福建東山到西沙群島的海域均有廣泛分布[1]。我們以稻瘟霉模型和體外細(xì)胞毒模型跟蹤篩選,將細(xì)薄星芒海綿中的具有抗癌活性的一系列異瑪拉巴烷(isomalabaricane)型三萜化合物命名為海綿總萜烯(STS),研究發(fā)現(xiàn),該物質(zhì)體內(nèi)外均顯示明顯的細(xì)胞毒活性,尤其對(duì)HL-60細(xì)胞株有強(qiáng)細(xì)胞毒活性,IC50<10-3mg/L。本課題進(jìn)行了STS對(duì)小鼠經(jīng)口、腹腔給藥急性毒性的研究,為臨床用藥提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 海綿 細(xì)薄星芒海綿(Stelletta tenuis Lindgren)采自我國(guó)南海三亞周邊海域,由中國(guó)科學(xué)院海洋研究所李錦和研究員鑒定為正品。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)昆明種小鼠,體質(zhì)量19～23 g,雌雄各半,上海復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 腹腔注射急性毒性試驗(yàn) 選用清潔級(jí)健康小鼠50只(上海復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部),雌雄各半,適應(yīng)環(huán)境3 d后進(jìn)行試驗(yàn)。小鼠體質(zhì)量為 18.5～21.4 g。按隨機(jī)均衡原則將小鼠均分為5組。按已設(shè)置的劑量分別對(duì)各組小鼠腹腔注射。試驗(yàn)前動(dòng)物禁食16 h,不限制飲水。給藥后4 h內(nèi)嚴(yán)密觀察并記錄,隨后每天上、下午各 1次,連續(xù)觀察14 d,詳細(xì)記錄小鼠中毒表現(xiàn)及死亡情況。對(duì)死亡動(dòng)物進(jìn)行尸檢。按改進(jìn)寇氏法計(jì)算所試藥物的LD50值。[2]

2.2 經(jīng)口急性毒性試驗(yàn) 取清潔級(jí)健康小鼠70只(上海復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部),體質(zhì)量18～22 g,禁食12 h(供水),按體質(zhì)量隨機(jī)分成7組,每組10只,雌雄各半,按10 mL/kg體質(zhì)量的容量經(jīng)口給藥,各組小鼠的給藥濃度分別為0.200、0.160、0.128、0.102、0.082、0.066、0.053 g/mL,以 0.5%CMC-Na 配制,用Bliss法計(jì)算LD50及其95%可信限。觀察14 d內(nèi)動(dòng)物毒性反應(yīng)情況和死亡情況,包括中毒癥狀,中毒發(fā)生時(shí)間、持續(xù)時(shí)間、恢復(fù)時(shí)間及動(dòng)物死亡時(shí)間等[3]。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 腹腔注射急性毒性試驗(yàn) 試驗(yàn)結(jié)果顯示,海綿總萜烯對(duì)小鼠具有一定的毒性作用,且隨著劑量的增大,其毒副作用也相應(yīng)增強(qiáng),有劑量效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)給藥劑量為300 mg/kg體質(zhì)量時(shí),小鼠即已出現(xiàn)中毒癥狀,主要表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)力下降、發(fā)紺。當(dāng)給藥劑量大于300 mg/kg體質(zhì)量時(shí),小鼠出現(xiàn)死亡。由改良寇氏法得到海綿總萜烯的半數(shù)致死量(LD50)為450 mg/kg體質(zhì)量,其95%的可信區(qū)間為409～495 mg/kg體質(zhì)量,結(jié)果見(jiàn)表1。

3.2 經(jīng)口急性毒性試驗(yàn) 給藥后24 h內(nèi)動(dòng)物活動(dòng)自如,毛緊貼身,有光澤,進(jìn)食飲水正常,糞便及其它情況均未見(jiàn)異常。動(dòng)物死亡發(fā)生在給藥后的第2～6天內(nèi),動(dòng)物死亡前安靜少動(dòng),聳毛,毛色無(wú)光澤,拒食拒水,肛門(mén)口有褐色糞便殘留物。死亡動(dòng)物經(jīng)尸檢肉眼觀察未見(jiàn)明顯病理改變(結(jié)果見(jiàn)表2～4)。

表1 海綿總萜烯小鼠腹腔注射急性毒性結(jié)果及LD50計(jì)算(n=10)

表2 海綿總萜烯經(jīng)口給藥對(duì)小鼠急性毒性死亡頻數(shù)表(n=10)

表3 海綿總萜烯經(jīng)口給藥對(duì)小鼠急性毒性體質(zhì)量變化±s,n=10) g

表3 海綿總萜烯經(jīng)口給藥對(duì)小鼠急性毒性體質(zhì)量變化±s,n=10) g

注:a表示n=3,b表示n=4,c表示n=5,d表示n=7,e表示n=8。

劑量/(g/kg)體質(zhì)量給藥前 第7天 第14天2.00 20.45±0.78 1.60 20.60±0.88 18.90±1.65a 26.27±3.46a 1.28 20.68±0.62 18.50±0.22b 26.88±3.17b 1.02 20.61±0.93 19.78±0.84c 27.92±0.69c 0.82 20.58±0.85 19.69±4.61d 27.97±3.51d 0.66 19.94±1.25 19.04±1.58e 28.71±1.98e 0.53 19.87±0.74 19.79±0.70 0.59±3.05

表4 海綿總萜烯經(jīng)口給藥對(duì)小鼠的急性毒性觀察結(jié)果(n=10)

4 小結(jié)

海綿總萜烯(STS),其化學(xué)組成清楚,產(chǎn)品純度高(海綿總萜烯的含量達(dá)到80%以上),產(chǎn)品得率高(約0.3%),動(dòng)物體內(nèi)外試驗(yàn)都表現(xiàn)出很好的抗腫瘤活性,對(duì)裸鼠A549肺癌和裸鼠結(jié)腸癌LS-174T模型有顯著的抗腫瘤作用,高劑量組(8 mg/kg體質(zhì)量,灌胃;4 mg/kg體質(zhì)量,腹腔注射)對(duì)腫瘤的抑制率分別達(dá)到78%和82%。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:小鼠灌胃海綿總萜烯的LD50為1.08 g/kg體質(zhì)量,小鼠腹腔注射海綿總萜烯的LD50約為0.45 g/kg體質(zhì)量,約相當(dāng)于最大治療劑量的125倍,初步推斷STS屬于低毒物質(zhì),口服給藥較為安全。

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