田維軍 張 鑫 趙金偉 侯 波 (吉林省人民醫(yī)院急診外科，吉林 長春 130021)

白細(xì)胞介素(IL)-1α是一種多功能細(xì)胞因子，主要由活化的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞合成并分泌，不僅參與炎癥反應(yīng)，而且在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。體外實驗顯示，IL-1α在結(jié)直腸癌細(xì)胞株中明顯高表達(dá)，可促進(jìn)腫瘤血管形成，并且與結(jié)直腸癌細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移有關(guān)〔1〕。臨床實驗顯示，結(jié)直腸癌患者血漿中IL-1α蛋白表達(dá)明顯升高〔2〕。迄今為止，尚未見結(jié)直腸癌中IL-1αmRNA的表達(dá)變化研究報道。本研究采用實時熒光定量PCR檢測IL-1αmRNA在結(jié)直腸癌及癌旁組織中的表達(dá)，并探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 樣本收集 收集手術(shù)切除結(jié)直腸癌及對應(yīng)癌旁組織標(biāo)本42例，其中男 25例，女 17例，年齡 45～69〔平均(57.1±12.4)〕歲。均經(jīng)組織病理學(xué)確診為結(jié)直腸癌，手術(shù)切除組織立即液氮凍存。

1.2 實時熒光定量PCR檢測 用Trizol法(TRIpure Reagent購自北京百泰克公司)提取結(jié)直腸癌組織及癌旁組織總RNA。反轉(zhuǎn)錄為cDNA，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行(反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司)。參照文獻(xiàn)〔3〕設(shè)計目的基因IL-1α引物:上游:5'-AGAAGAGACGGTTGAGTTTAAGCCAATCCA-3'，下游:5'-CTCAGGAAGCTAAAAGGTGCTGACCTA-3'，擴(kuò)增片段大小115 bp。內(nèi)參基因 GAPDH:上游引物:5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3';下游引物:5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'，引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。運(yùn)用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量分析，按照10、101、102、103和104梯度稀釋 cDNA，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用20μl反應(yīng)體系，含有cDNA模板2.0μl，SYBR Premix Ex TaqTM(2 ×)10.0 μl，上、下 游 引 物(10 μmol/L)各0.2 μl，RNase-free水補(bǔ)足體積至 20 μl。設(shè)置反應(yīng)條件:95℃ 10 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，設(shè)置95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s進(jìn)行熔解曲線分析。以GAPDH為內(nèi)對照，RNase-free水代替模板cDNA作為陰性對照。每個樣本復(fù)孔2管，軟件自動記錄Ct值。調(diào)整基線使目的基因IL-1α和內(nèi)參基因GAPDH閾值一致，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算基因的相對表達(dá)量。以IL-1α相對表達(dá)量/GAPDH相對表達(dá)量，得到校正后每個待測樣本IL-1α的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件，結(jié)直腸癌組織和癌旁組織IL-1αmRNA相對含量比較采用配對t檢驗，結(jié)直腸癌臨床特征之間的比較采用兩組獨(dú)立樣本t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 熔解曲線分析:單峰，高而尖，無鋸齒狀，表明引物特異性較好，無非特異性擴(kuò)增。標(biāo)準(zhǔn)曲線分析:目的基因和內(nèi)參基因的R2均＞0.98，表明直線擬合度較好;根據(jù)斜率，電腦自動計算目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率，均＞90%。待測樣本之間具有可比性。

2.2 IL-1αmRNA在結(jié)直腸癌中的表達(dá) IL-1αmRNA在結(jié)直腸癌組織中的相對含量(1.18±0.80)明顯高于癌旁組織(0.74±0.49)(t=-3.12，P=0.003)。IL-1α mRNA 在臨床Ⅲ～Ⅳ期結(jié)直腸癌組織中的相對含量明顯高于其Ⅰ～Ⅱ期(P=0.01);IL-1αmRNA在伴有轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌組織中的相對含量明顯高于其在無轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌組織中(P=0.002);IL-1α mRNA在不同分化程度結(jié)直腸癌中的表達(dá)無明顯差異。見表1。

表1 IL-1αmRNA表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床特征的相關(guān)性(±s)

表1 IL-1αmRNA表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床特征的相關(guān)性(±s)

臨床特征 n IL-1αmRNA相對含量 t值 P值24 1.06±0.71 -1.14 0.26低分化 18 1.34±0.90臨床分期 Ⅰ～Ⅱ 22 0.89±0.52 -2.67 0.01Ⅲ～Ⅳ 20 1.50±0.93轉(zhuǎn)移狀態(tài) 有 19 1.59±0.90 3.40 0.002無分化程度 高中分化23 0.84±0.50

3 討論

IL-1作為一種多向性細(xì)胞因子，不僅影響機(jī)體的炎癥和免疫反應(yīng)，而且具有調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的功能，在急慢性炎癥和腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。IL-1家族包括2個成員:IL-1α和IL-1β，兩者通過與IL-1 I型受體結(jié)合，參與腫瘤的演變過程。IL-1β可促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲〔4，5〕。外源性IL-1β干預(yù)結(jié)直腸細(xì)胞后，金屬基質(zhì)蛋白酶及其組織抑制劑基因表達(dá)明顯增加，這些基因的增加與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)〔6〕。IL-1β不僅與結(jié)直腸癌惡性生物學(xué)行為有關(guān)，而且與患者性別有關(guān)，Sharma等〔7〕報道IL-1β在男性結(jié)直腸患者中的表達(dá)明顯高于女性。與IL-1β作用類似，過表達(dá)IL-1α可通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞而促進(jìn)細(xì)胞生長、侵襲、轉(zhuǎn)移和腫瘤血管形成〔1，8〕。結(jié)直腸癌患者血漿中 IL-1α 蛋白表達(dá)明顯升高〔2〕。

本研究提示IL-1α有望作為結(jié)直腸癌發(fā)病新的生物學(xué)標(biāo)記物。關(guān)于IL-1α在結(jié)直腸癌發(fā)病中的作用機(jī)制，至今尚未完全闡明，推測IL-1αmRNA的異常升高導(dǎo)致了IL-1α蛋白表達(dá)增加，參與腫瘤惡變過程，介導(dǎo)結(jié)直腸癌發(fā)生。

1 Matsuo Y，Sawai H，Ma J，et al.IL-1alpha secreted by colon cancer cells enhances angiogenesis:the relationship between IL-1alpha release and tumor cells'potential for liver metastasis〔J〕.J Surg Oncol，2009;99(6):361-7.

2 Hillenbrand A，F(xiàn)assler J，Huber N，et al.Changed adipocytokine concentrations in colorectal tumor patients and morbidly obese patientscompared to healthy controls〔J〕.BMC Cancer，2012;12:545.

3 Moschen AR，Molnar C，Enrich B，et al.Adipose and liver expression of interleukin(IL)-1 family members in morbid obesity and effects of weight loss〔J〕.Mol Med，2011;17(7-8):840-5.

4 Li Y，Wang L，Pappan L，et al.IL-1beta promotes stemness and invasiveness of colon cancer cells through Zeb1 activation〔J〕.Mol Cancer，2012;11:87.

5 張 佳，羅和生，鐘清連.IL-1β及IL-1ra對結(jié)腸癌細(xì)胞表達(dá)uPA的影響〔J〕.胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2009;18(10):942-4.

6 Kapral M，Wawszczyk J，Jurzak M，et al.The effect of inositol hexaphosphate on the expression of selected metalloproteinases and their tissue inhibitors in IL-1beta-stimulated colon cancer cells〔J〕.Int J Colorectal Dis，2012;27(11):1419-28.

7 Sharma A，Greenman J，Walker LG，et al.Differences in cytokine levels due to gender in colorectal cancer patients〔J〕.Cytokine，2010;50(1):91-3.

8 史新龍，馬家馳，楊熊飛，等.白細(xì)胞介素1α及其受體拮抗劑對大腸癌細(xì)胞增殖、侵襲的影響〔J〕.中國普通外科雜志，2012;21(10):1231-5.