陳夢(mèng)揚(yáng)，魏 健，葛高波，孫 銘，馮秀智，吳可人，李永春，2，徐秋芳，2

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，浙江 臨安 311300；2.浙江農(nóng)林大學(xué) 浙江省森林生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)與固碳減排重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 臨安 311300）

蟲害是制約農(nóng)作物高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的重要因素。全球每年因蟲害所造成的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)損失約占農(nóng)作物總產(chǎn)量的15%[1]。生物農(nóng)藥由于對(duì)病蟲害防治效果好，對(duì)人畜安全無毒或低毒，無殘留，不易污染環(huán)境而受到人們的青睞[2]。生物農(nóng)藥對(duì)病蟲害特異性強(qiáng)，不殺傷害蟲的天敵和其他有益的生物；其活性成分為自然界本身存在的物質(zhì)，自然界有其順暢的降解途徑，不會(huì)破壞生態(tài)平衡[3]。生物農(nóng)藥中Bt的研發(fā)是最成功的，在微生物防治害蟲的實(shí)踐中占有極其重要的地位[4]。Bt殺蟲劑是細(xì)菌性殺蟲劑蘇云金桿菌Bacillus thuringiensis的簡(jiǎn)稱，至今已證明該菌對(duì)10個(gè)目522種昆蟲具有不同的致病力，尤其是對(duì)鱗翅目Lepidoptera幼蟲特別有效[5]。此外，Bt還是當(dāng)今研究最多、用量最大的殺蟲細(xì)菌，它占據(jù)了生物農(nóng)藥90%以上的市場(chǎng)，僅國(guó)內(nèi)其應(yīng)用面積就達(dá)到300萬hm2以上[6]。由于中國(guó)對(duì)生物農(nóng)藥的安全問題沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，生產(chǎn)企業(yè)自定產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)，都自認(rèn)為生物農(nóng)藥是安全無毒的。這種思想容易使生物農(nóng)藥在安全控制方面產(chǎn)生新的問題[7－8]。在生物農(nóng)藥應(yīng)用過程中一些有關(guān)于生態(tài)安全的問題還有待于進(jìn)一步研究，特別是對(duì)地下生態(tài)系統(tǒng)的影響。農(nóng)藥對(duì)土壤微生物的影響，已成為不少國(guó)家評(píng)價(jià)農(nóng)藥生態(tài)安全的一個(gè)重要指標(biāo)[9]。土壤微生物對(duì)所生存的微環(huán)境十分敏感，可對(duì)土地利用方式的改變以及人為干擾等做出反應(yīng)[10－11]。有研究表明，Bt蛋白進(jìn)入土壤后，會(huì)產(chǎn)生有殺蟲活性的結(jié)合態(tài)Bt蛋白，而且不易被土壤微生物分解；保留在土壤中的這些較低濃度的Bt蛋白可能會(huì)對(duì)非靶標(biāo)生物產(chǎn)生不利影響，即對(duì)土壤中微生物也可能產(chǎn)生一定影響[12]。正因?yàn)槿绱?，研究Bt殺蟲劑施用對(duì)地下生物的影響最好的指標(biāo)就是土壤微生物。但施用Bt殺蟲劑后對(duì)土壤微生物量和微生物群落結(jié)構(gòu)的影響至今鮮見報(bào)道。本研究選取典型的菜地土壤和松林土壤，通過噴施不同濃度梯度的農(nóng)藥，研究微生物量碳和微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性變化特征，為Bt殺蟲劑施用后地下生物安全評(píng)價(jià)提供直接的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土壤采集與理化性質(zhì)測(cè)定

采樣地點(diǎn)分別為浙江省臨安市太湖源鎮(zhèn)和錦城鎮(zhèn)。2個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)均屬于中緯度北亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，四季分明，氣候溫和，雨水充沛（年降水量為1420.0 mm），多年平均氣溫15.8°C。7月最熱，1月最冷。歷年平均日照時(shí)數(shù)為1939.0 h，無霜期234 d。2個(gè)取樣地區(qū)土壤為粉砂巖母質(zhì)上發(fā)育的紅壤土類，林地土壤取自一片有約50 a歷史的松林地，農(nóng)田土取自臨安市郊蔬菜生產(chǎn)基地。上述取樣地點(diǎn)在近期內(nèi)均未使用過同類殺蟲劑。在各取樣點(diǎn)按5點(diǎn)法分別采集0～20 cm的表層土壤樣品，樣品分別采集后帶回室內(nèi)稍微風(fēng)干后充分混勻，過2 mm鋼篩并分成2份，一份新鮮土樣供土壤微生物量碳測(cè)定使用，農(nóng)藥噴施以及冷凍干燥后置于－20℃保存用于DNA提取等，另一份風(fēng)干處理后用于土壤總有機(jī)質(zhì)、全氮、堿解氮、全磷等質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定。土壤理化性質(zhì)測(cè)定參照文獻(xiàn)[13]進(jìn)行。土壤基本理化性質(zhì)見表1。

表1 農(nóng)田和林地土壤基本理化性質(zhì)Table1 Physical and chemical characteristics of vegetable soils and pine forest soils

1.2 Bt殺蟲劑噴施處理

購(gòu)買市售寧農(nóng)牌蘇剎（煙臺(tái)金諾生物工程有限公司）蘇云金桿菌可濕性粉劑（16000×16.67 μkat·g－1），根據(jù)使用說明，該Bt殺蟲劑使用劑量范圍為375～2255 g·hm－2。據(jù)此分別設(shè)置3個(gè)噴施處理：375（T1），1315（T2）和 2255（T2） g·hm－2，并以不噴施農(nóng)藥只噴無菌雙蒸水為對(duì)照（T0）。采集土壤時(shí)測(cè)定所取土樣平均容重，計(jì)算出本研究中所需噴施Bt殺蟲劑的量為：0.144，0.506，0.867 μg·g－1土壤。將上述過篩的新鮮土壤稱取50 g置于滅菌培養(yǎng)皿中，并用無菌雙蒸水溶解Bt粉劑，按照上述處理每個(gè)培養(yǎng)皿噴施3 mL藥劑，同一類型土壤各個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。噴施結(jié)束后置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，中間定期向每塊培養(yǎng)皿補(bǔ)充等量無菌雙蒸水，以使土壤濕度保持在60%的田間最大持水量。在上述條件下培養(yǎng)7 d后，作為待測(cè)樣品進(jìn)行分析測(cè)定。

1.3 土壤微生物量碳測(cè)定與土壤總DNA提取

土壤微生物量碳采用氯仿-直接提取法[14]，對(duì)照土壤和熏蒸后土壤用0.5 mol·L－1硫酸鉀提?。ㄍ痢盟?1∶5），濾液中碳質(zhì)采用TOC-VCPH有機(jī)碳分析儀測(cè)定。土壤微生物量碳（Bc）以熏蒸和未熏蒸土壤0.5 mol·L－1硫酸鉀提取液中碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)之差乘以系數(shù)得到，Bc=2.64Ec，其中Ec為熏蒸土樣與未熏蒸土樣提取液碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)之差。所有測(cè)定均設(shè)3次重復(fù)。

采用PowerSoilTMTotal DNA Isolation Kit試劑盒提取土壤總DNA，稱取0.5 g于－20℃保存的土壤樣品，按試劑盒說明書進(jìn)行土壤DNA提取，提取后的DNA樣品保存于－20℃。

1.4 土壤總細(xì)菌的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）分析

采用一對(duì)通用引物F338-GC和518 r擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA基因V3區(qū)的一段長(zhǎng)約260 bp的片段，F(xiàn)338-GC∶5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′；518r∶5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′，使用 Bio-Rad 公司的 PTC-200 對(duì)土壤總 DNA 進(jìn)行擴(kuò)增。50.0 μL 反應(yīng)體系如下：10×聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），緩沖液 5.0 μL，氯化鎂（25.0 mmol·L－1） 3.0 μL，三磷酸堿基脫氧核苷酸（dNTP，2.5 mmol·L－1）1.0 μL，引物（10.0 μmol·L－1）各 0.5 μL，Taq DNA 聚合酶（5 × 16.67 nkat）0.2 μL，模板DNA 1.0 μL，用無菌雙蒸水補(bǔ)足至50.0 μL。反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。取3.0 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物用15.0 g·kg－1的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，檢測(cè)產(chǎn)物及其長(zhǎng)度。

使用 DCodeTMUniversal Mutation Detection System（Bio-Rad），在變性劑梯度為40%～60%的 80 g·kg－1聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行變性梯度凝膠電泳。電泳前對(duì)PCR產(chǎn)物定量、校正，使上樣量一致。在60℃，80 V條件下電泳13 h后，SYBR green I染色30 min，染色結(jié)果用Gel DocTMEQ（Bio-Rad）凝膠成像系統(tǒng)成像，使用Quantity One4.4軟件（Bio-Rad）進(jìn)行圖像分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，單因素方差分析比較各處理之間的差異顯著性（P＜0.05）。利用Quantity One 4.4軟件進(jìn)行圖譜分析時(shí)，主要采用未加權(quán)算術(shù)平均對(duì)群法（UPGMA，unweighted pair-group method using arithmetic averages）對(duì)變性梯度凝膠電泳（DGGE）圖譜進(jìn)行聚類分析。一般認(rèn)為相似值高于0.60的2個(gè)群體具有較好的相似性。使用CANOCO 4.5.1軟件 （Microcomputer Power，Ithaca，USA）對(duì)DGGE揭示的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行降趨勢(shì)對(duì)應(yīng)分析 （detrended correspondence analysis，DCA）[15]。使用Shannon多樣性指數(shù)（H），Margalef豐富度指數(shù)（D）以及Pielou均勻度指數(shù)（E）對(duì)土壤細(xì)菌微生物群落多樣性進(jìn)行分析[16]，其計(jì)算公式為：H=－∑（ni/N）ln（ni/N）；D=（S－1）/lnN；E=H/lnS。其中：ni為每條電泳條帶光密度峰值，N是同一泳道中所有條帶光密度峰值總和。電泳條帶光密度的峰值通過分析軟件Quantity one進(jìn)行讀取。S為每一泳道總的條帶數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bt殺蟲劑的施用對(duì)土壤微生物量碳的影響

表2為分別對(duì)菜地土和松林土噴施Bt殺蟲劑后其微生物量碳的變化特征。對(duì)菜地土而言，隨著Bt殺蟲劑噴施比例的增加，微生物量碳變化并沒有呈現(xiàn)出線性增加或減少的趨勢(shì)；與未施用殺蟲劑的對(duì)照T0相比，T1使得土壤中微生物碳顯著下降（P＜0.05），T2使得土壤中微生物量碳顯著增加（P＜0.05），但T3并沒有明顯差異。而對(duì)松林土而言，隨著Bt殺蟲劑噴施比例的增加，微生物量碳變化總體上表現(xiàn)出增加的趨勢(shì)，但仍然呈現(xiàn)出非線性的變化特征；與未施用殺蟲劑的對(duì)照相比，T1施用并沒有使土壤中微生物量碳顯著增加，但T2和T3的施用均顯著增加土壤中微生物量碳 （P＜0.05）；且與菜地土壤類似，T2的微生物量碳達(dá)到一個(gè)最高峰。施用不同劑量的Bt殺蟲劑后，導(dǎo)致了土壤微生物活性不同程度的增加或減弱，從而導(dǎo)致微生物量碳上升和下降。

土壤微生物量碳與有機(jī)碳的比值能較好地表征土壤碳的動(dòng)態(tài)變化。比值越大，說明有機(jī)碳周轉(zhuǎn)速率越快。據(jù)Zeller等[17]研究報(bào)道，土壤微生物量碳占有機(jī)碳的比例范圍為0.27%～7.00%。本研究所選取的土壤及其噴施Bt殺蟲劑后，該結(jié)果也處于此范圍內(nèi)，屬于正常值。由表2可以看出，對(duì)菜地土而言，除了T2外，噴施農(nóng)藥后土壤微生物量碳/有機(jī)碳的比值均降低，可見Bt殺蟲劑的施用抑制了土壤微生物的生長(zhǎng)代謝作用，從而降低了有機(jī)碳的周轉(zhuǎn)速度。就松林土壤而言，施用Bt殺蟲劑后土壤微生物量碳/有機(jī)碳的比值均升高，表明Bt殺蟲劑的施用顯著促進(jìn)了土壤微生物的生長(zhǎng)代謝作用，從而增加了有機(jī)碳的周轉(zhuǎn)速度。

表2 施用Bt殺蟲劑后土壤碳變化Table2 Change of soil carbon content after spraying Bt insecticide

2.2 Bt殺蟲劑的施用對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 Bt殺蟲劑施用后菜地土和松林土細(xì)菌群落的DGGE帶譜分析 土壤微生物總DNA經(jīng)過PCR擴(kuò)增后，均獲得特異性較強(qiáng)的16S rDNA V3區(qū)目標(biāo)條帶。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析，Quantity one軟件能識(shí)別肉眼無法看清和區(qū)分的條帶圖譜，結(jié)果見圖1。從圖1中可以看出，菜地土壤與松林土壤DGGE圖譜帶型有較大的差異，菜地土壤細(xì)菌群落具有更高的豐富度。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明：松林土壤及其噴施Bt殺蟲劑處理后，4個(gè)處理樣品平均有32條帶，且噴施農(nóng)藥前后樣品條帶數(shù)沒有明顯差異；菜地土壤及其噴施Bt殺蟲劑處理后，4個(gè)處理樣品平均有41條帶，但噴施農(nóng)藥后樣品平均條帶數(shù)（45）顯著多于未噴施的空白對(duì)照（38）（P＜0.05）。可見，對(duì)菜地土壤而言，農(nóng)藥的噴施增加土壤中細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)條帶數(shù)目。

圖1 松林土和菜地土噴施Bt殺蟲劑后細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增片段的DGGE分析結(jié)果Figure1 DGGE analytical results of 16S rDNA fragment of bacterial communities from soil samples for vegetable soils and pine forest soils after spraying Bt insecticide

2.2.2 Bt殺蟲劑施用后土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相似性分析 以菜地土壤T3處理的1號(hào)樣品為基準(zhǔn)，應(yīng)用Quantity one軟件定量分析DGGE圖譜，與基準(zhǔn)樣品相似度越高，說明細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)越相似。結(jié)果表明：菜地土壤類型的各處理樣品與其有更高的相似性，表明重復(fù)性較好。菜地土各處理樣品與松林土各處理樣品之間的相似度最低。通過未加權(quán)算術(shù)平均對(duì)群法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析表明，同一類型土壤的樣品各自被聚為一大類（圖2），且菜地土和松林土各自12個(gè)樣品相似值分別為0.63和0.66，而2種土壤類型之間相似值只有0.55。說明同一類型土壤4個(gè)處理12個(gè)樣品間的相似度，高于不同類型土壤樣品之間的相似度，土壤細(xì)菌的群落在同一土壤類型下比較穩(wěn)定，也表明Bt殺蟲劑的噴施對(duì)土壤細(xì)菌群落的影響并不大。

圖2 松林土和菜地土噴施Bt殺蟲劑后細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增片段的DGGE條帶圖譜的聚類分析Figure2 Cluster analysis of 16S rDNA fragment of bacterial communities from soil samples for vegetable soils and pine forest soils after spraying Bt insecticide

2.2.3 Bt殺蟲劑施用后土壤細(xì)菌群落的降趨對(duì)應(yīng)分析（DCA）為更進(jìn)一步考察土壤樣品間細(xì)菌群落的相對(duì)相似度，本研究又進(jìn)行基于DGGE條帶位置和相對(duì)光密度值的降趨勢(shì)對(duì)應(yīng)分析（DCA）。如圖3，松林土壤噴施Bt殺蟲劑后，土壤微生物群落仍然比較相似，且與菜地土各處理的12個(gè)樣品截然分開。菜地土噴施農(nóng)藥的各處理樣品間微生物群落相似性較高，但與未噴施農(nóng)藥的空白對(duì)照有一定差異，表明噴施農(nóng)藥對(duì)菜地土壤細(xì)菌群落造成了一定影響。此外，2種土壤在噴施Bt殺蟲劑后都表現(xiàn)出一致的規(guī)律，即不同梯度的Bt殺蟲劑噴施并未能使其細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)形成明顯差異，也進(jìn)一步證實(shí)Bt殺蟲劑并不是決定土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵因素。

2.3 Bt殺蟲劑的施用對(duì)土壤細(xì)菌群落多樣性的影響

Shannon指數(shù)反映了群落中物種的變化度或差異度，受樣本總數(shù)和均勻度的影響。一般來說，物種豐富度高且分布較均勻的群落的Shannon指數(shù)較高[18]。對(duì)菜地土和松林土噴施不同濃度梯度的Bt殺蟲劑后，分析土壤的DGGE條帶并進(jìn)行香農(nóng)多樣性指數(shù)（Shannon index）計(jì)算（表3），結(jié)果表明菜地土噴施Bt殺蟲劑后多樣性指數(shù)顯著上升（P＜0.05），而松林土噴施Bt殺蟲劑后，T1和T2的多樣性指數(shù)顯著下降（P＜0.05），但T3卻未見明顯變化。

圖3 松林土和菜地土噴施Bt殺蟲劑后細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增片段的DGGE條帶圖譜的DCA分析Figure3 DCA of 16S rDNA fragment of bacterial communities from soil samples for vegetable soils and pine forest soils after spraying Bt insecticide

表3 噴施Bt殺蟲劑后菜地土和松林土細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性指數(shù)Table3 Diversity indices of soil bacteria community of vegetable soils and pine forest soils after spraying Bt insecticide

3 結(jié)論與討論

微生物源殺蟲劑對(duì)非靶標(biāo)生物并無不良影響，但對(duì)地下生物安全的評(píng)價(jià)尚無系統(tǒng)和全面研究的報(bào)道。本研究選取典型的農(nóng)田和林地土壤，在室內(nèi)進(jìn)行可控制條件下的不同比例Bt殺蟲劑噴施處理，影響因素相對(duì)單一，力求真實(shí)反映Bt殺蟲劑噴施對(duì)土壤微生物量、微生物群落結(jié)構(gòu)以及多樣性的影響。土壤微生物量能靈敏地反映環(huán)境因子、土地經(jīng)營(yíng)模式和生態(tài)功能的變化，土壤微生物量碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)也是反映土壤品質(zhì)變化的理想指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，噴施Bt殺蟲劑后菜地和林地土壤微生物量碳均較不噴施的對(duì)照有顯著變化，2種土壤類型隨Bt殺蟲劑噴施比例的增加，微生物量碳均呈現(xiàn)出非線性的變化規(guī)律。一個(gè)非常有趣的現(xiàn)象是，T2對(duì)2種土壤類型的微生物量碳均顯著高于未噴施的對(duì)照且達(dá)到峰值，由此也說明：經(jīng)T2處理后，土壤微生物活性顯著增加，表明土壤生物學(xué)活性上升。但2種土壤類型在噴施Bt殺蟲劑后，微生物量碳變化的趨勢(shì)并不一致，表明土壤微生物受外界因素的影響程度與本身的結(jié)構(gòu)和多樣性有關(guān)，因此，2種土壤出現(xiàn)不同的規(guī)律也是正常的。

細(xì)菌是土壤中多樣性最豐富的微生物類群，占土壤微生物總數(shù)的70%～80%[19]，在土壤養(yǎng)分循環(huán)中起著至關(guān)重要的作用。應(yīng)用傳統(tǒng)平板方法不能完整地反映土壤細(xì)菌的真實(shí)情況，所分離得到的微生物只占總量的1%～5%[20]。近10 a來，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，不經(jīng)微生物分離培養(yǎng)步驟，直接從土壤中抽提總DNA，分析其中16S rDNA的序列多態(tài)性的研究方法，有效克服了傳統(tǒng)方法的缺點(diǎn)，能較好地揭示復(fù)雜的土壤微生物多樣性。本研究對(duì)運(yùn)用上述方法得到的DGGE圖譜統(tǒng)計(jì)分析表明，菜地土壤細(xì)菌種群具有更高的豐富度。與松林土不同的是，菜地土噴施農(nóng)藥后，優(yōu)勢(shì)條帶數(shù)顯著增加，從一定程度上反映出土壤中細(xì)菌優(yōu)勢(shì)種群數(shù)目有所增加。從DGGE圖譜相似性分析的結(jié)果看，菜地和松林土壤2種類型自身各處理之間有較好的相似性，且2種土壤類型細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)能夠截然分開，可見影響微生物群落結(jié)構(gòu)相似性的最主要因素仍然是土壤類型及地表植被。另外，同一種類型土壤相同處理的樣品之間微生物群落結(jié)構(gòu)存在一定的生物學(xué)變異，可見，噴施不同比例Bt殺蟲劑，并未使同一類型的土壤形成不同的微生物群落結(jié)構(gòu)。由此進(jìn)一步證實(shí)，土壤微生物受外界因素影響程度與本身的群落結(jié)構(gòu)和多樣性有關(guān)。

從多樣性指數(shù)來看，噴施Bt殺蟲劑后菜地土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)均明顯上升，松林土壤除噴施最高比例Bt殺蟲劑的處理多樣性指數(shù)未見明顯變化外，其余2個(gè)噴施比例的樣品細(xì)菌多樣性指數(shù)均顯著下降。從2種土壤的理化性質(zhì)來看，松林土壤酸度較高且相對(duì)貧瘠，可見土壤自身的特性影響到噴施Bt農(nóng)藥后的細(xì)菌多樣性指數(shù)。已有的研究表明，施加生物農(nóng)藥（Bt和苦參堿）的土壤中微生物（細(xì)菌、真菌）數(shù)量和種類豐富程度，要相對(duì)次于未施加生物農(nóng)藥的土壤。但其研究方法僅限于可培養(yǎng)菌落的形態(tài)和數(shù)量，今天看來該方法有很大的局限性。因此，本研究的結(jié)果應(yīng)引起我們的高度重視，即是說2種類型的土壤，噴施Bt殺蟲劑后多樣性指數(shù)變化的趨勢(shì)截然不同，故而不能對(duì)生物農(nóng)藥特別是Bt殺蟲劑對(duì)地下微生物的影響一概而論。

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