代曉炫，朱 偉，2，李 明

(1:河海大學環(huán)境學院，南京 210098)

(2:水資源高效利用與工程安全國家工程研究中心，南京 210098)

我國湖泊、水庫富營養(yǎng)化嚴重，藍藻水華頻繁發(fā)生.在各種類型的水華暴發(fā)實例中，微囊藻屬(Microcystis)是最為常見的水華藻類之一.湖泊的實際調(diào)查表明，湖泊中的微囊藻一般是由少則幾十上百個，多則成千上萬的細胞形成的群體賦存[1-2]，在暴發(fā)期，能看到明顯的顆粒狀、絮團狀的微囊藻群體漂浮聚集在水體表面.群體的形成使微囊藻更容易克服風浪擾動從而上浮聚集[3]，也能夠避免被水蚤、輪蟲等浮游動物大量捕食[4]，這可能是微囊藻水華形成的關(guān)鍵因素之一.然而在實際湖泊中以群體出現(xiàn)的微囊藻，在室內(nèi)的培養(yǎng)試驗中，卻很難出現(xiàn)類似野外的大群體.雖然有很多研究討論浮游動物捕食，微生物以及環(huán)境條件對群體形成的影響，但形成群體的物質(zhì)機制還不夠清晰.

一般認為微囊藻形成群體的物質(zhì)基礎是細胞外由多糖構(gòu)成的膠鞘組織.Martin 等[5]通過染色在電鏡下觀察到邊緣微囊藻(Microcystis marginata)在形成群體的過程中胞外有膠被存在，同時認為群體是由膠被包裹新分裂的細胞而形成.Plude 等[6]對水華微囊藻的膠被成分進行了分析，明確了這層膠被的主要成分為多糖類化合物，稱之為EPS.De Philippis 等[7]認為EPS 能夠影響細胞表面的厚度，并能導致藻的團聚.Yang等[8]于2008年發(fā)現(xiàn)在鞭毛蟲的捕食壓力下銅綠微囊藻會形成小群體，同時總多糖和胞外多糖都有增多.Liu等[9]則發(fā)現(xiàn)在添加乙醛酸的處理下，柵藻的總糖增加且和群體的細胞個數(shù)呈正相關(guān)性.可見，EPS 是微囊藻群體形成的物質(zhì)基礎，是直接影響微囊藻是否形成群體形態(tài)的關(guān)鍵物質(zhì).而其他因素對群體形成的影響首先通過影響細胞EPS 的多少，從而對群體形態(tài)產(chǎn)生影響.那么，微囊藻在細胞生長分裂過程中EPS 是如何產(chǎn)生的，又受到什么因素的影響而成為備受關(guān)注的問題.2005年張曉峰等[10]調(diào)查了從春初到夏季太湖微囊藻復蘇的過程，初春季節(jié)未見微囊藻膠被存在，但隨著時間推移，微囊藻細胞外面出現(xiàn)明顯的膠被并聚成較大的藻團，到夏季暴發(fā)期微囊藻細胞膠被物質(zhì)即多糖的增多而形成大群體聚集到湖水表面.但微囊藻EPS 增加過程中環(huán)境條件的影響并不清楚.

藍藻細胞通過光合作用合成碳水化合物，然后根據(jù)生理活動的需要合成核酸、蛋白質(zhì)、多糖及酯類等.單個細胞中多糖的多少實際上取決于多糖與微囊藻細胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)的比例關(guān)系.在細胞分裂過程中與多糖合成有關(guān)的物質(zhì)主要是C、H、O，而在自然水體中C、H、O 都是充足的，因此這3 種物質(zhì)不會成為多糖合成的限制因素.一些研究證實N 的多少直接影響藻類蛋白質(zhì)的合成量，而核酸的合成受到N、P 的影響[11-13]，且核酸中的RNA 會影響蛋白質(zhì)的合成.因此微囊藻生存環(huán)境中N、P 的含量變化，可能會通過藻細胞中蛋白質(zhì)、RNA 的含量而影響多糖在單細胞生物量中的比例，從而對能否產(chǎn)生足夠的膠鞘組織而形成群體發(fā)生影響.施軍瓊等[14]在2008年研究了多種環(huán)境因子對銅綠微囊藻多糖產(chǎn)量的影響，認為略低的N 濃度會提高總糖含量，而較高的N 濃度則降低了其總糖的含量但提高了EPS 的合成，其實驗結(jié)果只反映了單位體積藻液的產(chǎn)率變化，與藻密度的影響有關(guān).雷臘梅等[15]在2007年研究了N、P、S、Fe、EDTA 對胞外多糖產(chǎn)生的影響，認為N、P 都會刺激EPS 的產(chǎn)生，其他營養(yǎng)條件的改變對EPS 的影響不大，但是其研究只單獨關(guān)注了藻細胞溶出的多糖量所受到的影響.

從N、P 濃度會影響蛋白質(zhì)、RNA 的數(shù)量從而影響多糖在細胞中的比例這一基本認識出發(fā)，本研究通過改變N、P 濃度進行銅綠微囊藻的培養(yǎng)實驗，測定微囊藻細胞的蛋白質(zhì)、RNA、多糖的含量及3 種形態(tài)多糖的含量的變化.探討N、P 濃度對細胞中多糖比例及形態(tài)的影響以及其影響機理.

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)方法及實驗參數(shù)

培養(yǎng)實驗參照常用的方法.實驗所用銅綠微囊藻(FACHB-469)購自中國科學院武漢水生生物研究所，采用 M11 培養(yǎng)基(100 mg NaNO3、10 mg K2HPO4、75 mg MgSO4·7H2O、40 mg CaCl2·2H2O、20 mg Na2CO3、6 mg檸檬酸鐵和1 mg Na2EDTA·2H2O、1 L 蒸餾水)，使用250 ml 的錐形瓶(150 ml 培養(yǎng)基)，溫度為25℃，光照強度為3000 lx，每天搖瓶3 次并隨機調(diào)換錐形瓶的位置以保證光照均勻.光暗比為12 h∶12 h，初始接種密度為10×104cells/ml，整個培養(yǎng)過程均保持無菌操作.

實驗設置了N 控制組和P 控制組，每組5 個濃度梯度，各3 個平行.N 控制組在M11 培養(yǎng)基的基礎上通過添加或減少 NaNO3來改變 N 的濃度，實驗梯度為:3.29、8.24、16.47(原 M11 培養(yǎng)基濃度)、32.94、82.35 mg/L.P 控制組在M11 培養(yǎng)基的基礎上通過添加或減少K2HPO4來改變P 的濃度，實驗梯度為:0.18、0.36、0.89、1.78(原 M11 培養(yǎng)基濃度)、3.56 mg/L.

1.2 測定指標及方法

通過預實驗可知，各組培養(yǎng)實驗進行到第8 d 時，細胞都會處于對數(shù)生長期.此次實驗以對數(shù)生長期的細胞為對象，因此取第8 d 的藻樣進行測定.測定指標有:藻細胞密度、3 種形態(tài)多糖含量、細胞中的蛋白質(zhì)含量、RNA 含量.

藻細胞密度及生長率的計算:藻細胞密度與藻液吸光度之間存在顯著線性相關(guān)關(guān)系[16]，用分光光度計(島津UV-2450)對原藻種進行了400 ～800 nm 吸收掃描，確定本藻種的最大吸收波峰為680 nm，建立藻細胞密度與吸光度之間的關(guān)系曲線:生物量(106cells/ml)=24.693A680-0.3282(R2=0.9982).在試驗所采用的培養(yǎng)基N、P 濃度范圍內(nèi)培養(yǎng)藻液對這一關(guān)系曲線進行驗證，其線性關(guān)系穩(wěn)定.因此，藻細胞密度可通過測定吸光度后用此關(guān)系曲線換算獲得.生長率(μ)可通過對數(shù)生長曲線μ =ln(N2/N1)/(t2-t1)計算得到，其中，N1、N2為時間 t1、t2下的藻密度.

多糖的測定:針對多糖的類型，Yang 等[8]把多糖分為胞內(nèi)多糖IPS、固著性胞外多糖bEPS 和溶解性胞外多糖sEPS.本次實驗也采用此分類方法對3 種不同類型的多糖進行測定.取藻液20 ml，在10500 轉(zhuǎn)/min離心15 min 使藻液分離，取上清液測定溶解性胞外多聚糖sEPS.上述離心后的藻團加入10 ml 去離子水，再加入0.5 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 為10，搖勻后置于水浴震蕩器中，45℃溫水震蕩4 h，然后10500 轉(zhuǎn)/min離心15 min，上清液用于測定固著性胞外多聚糖bEPS.第二次離心后的藻團加0.5 mol/L NaOH 后沸水浴10 min 使胞內(nèi)多聚糖溶解出來，加入體積分數(shù)17%的三氯乙酸沉淀色素和蛋白，在10500 轉(zhuǎn)/min 離心15 min，上清液用于測定胞內(nèi)多聚糖IPS 含量.取上述3 次的濾液各2 ml 用蒽酮法測定多聚糖含量.最后根據(jù)藻細胞密度的實測值可計算出單細胞所含胞外多聚糖EPS 和胞內(nèi)多聚糖IPS 的量.

細胞中蛋白質(zhì)、RNA 含量測定:取10 ml 藻液測定其TC 值，將剩余的藻液離心，用冷凍干燥的方法除去細胞中水分，得到干藻樣，便于保存待測定蛋白質(zhì)及RNA.用元素分析儀得到干藻樣中的C 含量，對藻液TC濃度與干藻樣的TC 含量進行換算，以得到藻細胞的平均干重.取一定質(zhì)量的干藻樣，加0.5 mol/L NaOH 溶液，先用凍融法初步破碎細胞，再于100℃恒溫水浴10 min 提取，離心后用考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量.取一定質(zhì)量的干藻樣，加10%高氯酸溶液，凍融后于90℃恒溫水浴30 min，離心后再重復上述提取過程，兩次的離心液合并后用地衣酚顯色法測定RNA 含量.使用二苯胺法對提取液中的DNA 進行測定，測得提取液中DNA 含量極低，因此未對RNA 含量進行修正.

2 結(jié)果

2.1 微囊藻的細胞密度與生長率

對處于對數(shù)生長期，培養(yǎng)至第8 d 時，N、P 兩組實驗的藻細胞密度及生長率進行整理(圖1).隨著N 濃度的升高，N 組的藻細胞密度從760×104cells/ml 升至965×104cells/ml，生長率從0.54 d-1增加到0.57 d-1;P 組的藻細胞密度在595×104～811×104cells/ml 范圍之間變化，隨著P 濃度的升高，其藻細胞密度開始時不斷升高，但當P 濃度超過1.8 mg/L 后，到第5 組其生物量下降，對應的生長率從0.51 d-1升至0.55 d-1再降至0.54 d-1.

2.2 細胞中蛋白質(zhì)、RNA、總糖含量的變化

使用細胞密度、單細胞的干重和實測各物質(zhì)的總量進行計算，可以得到平均單細胞中蛋白質(zhì)、RNA 和總糖(TPS)的含量(圖2).微囊藻細胞中蛋白質(zhì)的含量最高，RNA 含量一般只有蛋白質(zhì)的一半以下.總糖含量最低，一般是細胞質(zhì)量的10%左右.

在N 發(fā)生改變的N 組，蛋白質(zhì)含量明顯隨著N 含量的升高而升高，從3.63 pg/cell 增至5.88 pg/cell;RNA 含量則基本不發(fā)生變化，保持在1.9 ～2.2 pg/cell 之間;總糖含量則隨著N 的增加明顯減少，從0.87 pg/cell降至 0.78 pg/cell，減少 10%(圖 2a).

在P 發(fā)生改變的P 組，蛋白質(zhì)含量變化不大，基本保持在4.40 ～4.83 pg/cell 之間;RNA 含量也沒有發(fā)生顯著變化;只有總糖隨著P 的升高有明顯的下降趨勢(圖2b).

圖2 N 組(a)和P 組(b)的細胞中蛋白質(zhì)、RNA、總糖含量的變化Fig.2 Changes in the contents of protein，RNA and TPS in cells of different N(a)and P(b)groups

2.3 多糖與蛋白質(zhì)、RNA之間的比例關(guān)系

TPS 與蛋白質(zhì)的比值及RNA 比值，可以反映細胞中多糖的含量與蛋白質(zhì)、RNA 之間的比例關(guān)系，結(jié)果可以看出，隨著N、P 的增加，TPS/蛋白質(zhì)或TPS/RNA 都呈現(xiàn)減少的趨勢(圖3).

N 組的TPS/蛋白質(zhì)的值隨N 濃度升高一直下降，從0.237 下降至0.147;TPS/RNA 的比值則有所波動，但總體仍在0.362 ～0.408 之間表現(xiàn)出下降趨勢(圖3a).P 組的TPS/蛋白質(zhì)的比值則有所波動，但基本在0.16 ～0.17 之間呈下降趨勢;而TPS/RNA 值隨著P 濃度的升高一直下降，從0.421 下降至0.354(圖3b).

圖3 N 組(a)和P 組(b)細胞總糖與蛋白質(zhì)、RNA 之間的比例關(guān)系Fig.3 Ratios of TPS to protein and RNA in cells of N(a)and P(b)groups

2.4 三種形態(tài)多糖的含量

P 組的胞內(nèi)多糖含量在0.38 ～0.41 pg/cell 之間，變化很少;但是N 組的胞內(nèi)多糖含量從0.46 pg/cell降至0.35 pg/cell，下降了23.81%.N 組的固著性多糖與其胞內(nèi)多糖有相同的趨勢，但溶解性多糖的趨勢相反.P 組的固著性多糖基本無變化，但溶解性多糖稍有減小(圖4).

3 討論

從實驗結(jié)果來看，N 的濃度升高能使單細胞所含蛋白質(zhì)明顯增多，從3.63 pg/cell 增至5.88 pg/cell，這與Downing 等[12]以及Vézie 等[13]得出的高N 濃度促進微囊藻蛋白質(zhì)的合成的結(jié)論類似，這種規(guī)律在小球藻、柵藻、顫藻等藻類中也有發(fā)現(xiàn)[11].而在實驗濃度范圍內(nèi)P 對單細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的含量沒有明顯的影響.

圖4 N 組(a)和P 組(b)細胞3 種形態(tài)多糖的含量Fig.4 Contents of three patterns of polysaccharide in cells of N(a)and P(b)groups

單細胞中RNA 的數(shù)量相對比較穩(wěn)定，P 的增加能使RNA 有微量的增加，而N 基本上不對RNA 的含量產(chǎn)生影響.P 是合成RNA 的必需元素，在實驗所設置的最低P 濃度時，RNA 的合成就已經(jīng)能滿足細胞的生理需要，因此沒有對RNA 的合成產(chǎn)生制約作用.

無論是N 的增加還是P 的增加都造成了多糖含量的降低，這與N、P 充足時光合作用的產(chǎn)物優(yōu)先以蛋白質(zhì)、RNA 的形式出現(xiàn)，而多糖的數(shù)量則相對減少有關(guān).楊州等[17]在2008年的一篇綜述中報道，在N 或P 不足時，藻類光合作用固定的有機物質(zhì)主要以不含N、P 的碳水化合物形式存在;在碳氮代謝不平衡的情況下，胞外多聚糖充當了接收過剩固定碳的匯.本實驗的結(jié)果從另一個方面證實了這一觀點，說明在N、P 充足條件下，藻類光合作用固定的有機物質(zhì)主要以含有N、P 的碳水化合物形式存在.De Philippis 等[18]在1993年的研究中也提出相同觀點，本實驗的結(jié)果與其一致.

從對微囊藻群體形成的角度來看，胞外固著性多糖的數(shù)量值得關(guān)注.N 濃度升高使總糖降低了10%，其中胞內(nèi)多糖占總糖的比例降低了8.2%，固著性胞外多糖占總糖的比例降低了6.4%，相反，溶解性胞外多糖所占比例卻增加了14.6%，溶解性多糖的變化和雷臘梅等[15]的研究結(jié)果一致.可以看出，N 的增加不但降低了單細胞內(nèi)多糖的含量，也改變了細胞中3 種形態(tài)多糖的比例關(guān)系，胞外多糖所占比例從46.6%增至54.8%，即N 的增加促進了多糖向胞外分泌，并且胞外多糖中溶于水中的比例也增加，固著性多糖的比例降低.P 濃度的升高使總糖降低了6.1%，胞內(nèi)多糖、溶解性胞外多糖和固著性胞外多糖含量雖然出現(xiàn)一些浮動，但無明顯變化趨勢，即P 的濃度對多糖形態(tài)的影響不太明顯.

單細胞中固著性多糖的含量決定了微囊藻細胞的形態(tài)，在微囊藻光合成作用時，N 促進蛋白質(zhì)快速合成，P 能使RNA 合成略有增加，N、P 充足使微囊藻細胞的繁殖速度加快.本文N 增加可使生長率從0.54 d-1增加到0.57 d-1，P 增加可使生長率從0.51 d-1增加到0.55 d-1(圖1)，而野外原位調(diào)查及原位培養(yǎng)[19]所測得的原位生長速率一般都低于0.20 d-1.可以推測，在快速的分裂增殖過程中，光合作用優(yōu)先生成RNA 和蛋白質(zhì)，而作為儲能物質(zhì)的多糖數(shù)量則減少，細胞在多糖合成較少的情況下分裂、繁殖，造成了單細胞內(nèi)多糖含量偏少的結(jié)果.同時，由于固著性多糖數(shù)量不足，導致培養(yǎng)實驗得到的微囊藻很難黏著在一起形成群體形態(tài)，而是以單細胞的形態(tài)出現(xiàn)，這可能是高生長率培養(yǎng)實驗難以培養(yǎng)出群體細胞的原因之一.

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