駱 丹，辛培勇，閆吉軍，3，房 爽，孫曉紅，閆 靜，褚金芳，閆存玉

（1.中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所，國家植物基因研究中心（北京），北京 100101；2.黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院，黑龍江 哈爾濱 150040；3.青島科技大學化工學院，山東 青島 266042）

植物激素是植物體內(nèi)合成的，參與調(diào)控植物生長發(fā)育、適應生物與非生物脅迫等植物生理過程的重要信號分子的總稱，在極低濃度下即可發(fā)揮其生理作用。除了已發(fā)現(xiàn)和報道的傳統(tǒng)類別植物激素，例如生長素、乙烯、細胞分裂素、赤霉素和油菜素等種類外，最新研究發(fā)現(xiàn)表明，獨角金內(nèi)酯（strigolactones，SLs）能夠參與調(diào)控植物側枝形成，是一類全新結構形式的植物激素［1－2］。SLs能夠影響水稻等重要農(nóng)作物的株型，進而影響其產(chǎn)量，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領域有著重要的研究價值。SLs是具有倍半萜內(nèi)酯（sesquiterpene lactone）結構特征的植物信號分子，最初是在研究寄生植物獨角金（striga）與宿主植物信號關系過程中發(fā)現(xiàn)的，宿主植物合成的SLs通過根系分泌并被寄生植物種子感知，誘導其種子萌發(fā)，并建立寄生關系［3］；此外，當土壤中磷等營養(yǎng)元素缺乏時，植物根際分泌的SLs作為信號分子，還能夠被根際微生物叢枝菌根真菌（AM fungi，arbuscular mycorrhizal fungi）識別，促進AM 真菌的菌絲形成和孢子萌發(fā)，從而幫助植物吸收土壤中的磷等營養(yǎng)元素［4］。植物界80%的植物可以與AM真菌形成共生關系，因此大部分的植物根際都分泌SLs［5］，但是研究發(fā)現(xiàn)，對于不與AM菌根建立共生關系的植物，例如擬南芥，其根部也能夠分泌SLs，部分植物的地上部分亦可檢測到SLs，這些研究表明，SLs除了作為根部分泌的信號分子，可能也參與調(diào)控植物地上部分的生長發(fā)育［6－8］。目前，在植物研究領域發(fā)現(xiàn)和報道的SLs類化合物已經(jīng)超過十幾種，這類化合物極性較小，易溶于乙酸乙酯、丙酮和氯仿等有機溶劑中，其分子結構由ABC并環(huán)通過烯醚鍵連接D環(huán)構成，ABC并環(huán)和D環(huán)均具有內(nèi)酯結構特征。利用遺傳學手段，通過對模式植物擬南芥和水稻max和d系列突變體的研究發(fā)現(xiàn)，SLs均是通過類胡蘿卜素合成途徑多步酶催化反應合成的，其合成途徑正處于深入研究階段［9－11］。由于SLs類化合物結構多樣，且廣泛發(fā)現(xiàn)于多個物種中，其結構與功能關系是未來的重要研究方向［12－17］?；陔妵婌F離子化的高分辨串聯(lián)質(zhì)譜技術能夠為復雜結構天然產(chǎn)物的定性結構表征提供詳盡可靠的數(shù)據(jù)和信息，能夠與SLs植物生理功能研究互為補充，為深入研究此類植物信號分子的分子作用機制奠定基礎。目前，系統(tǒng)性研究此類化合物質(zhì)譜碎裂特征的結果還未見報道。

本工作分別選取具有結構代表性的3種SLs化合物作為研究對象，其結構式示于圖1。系統(tǒng)地研究羥基化SLs（Strigol）、脫羥基化SLs（5－deoxystrigol，5－DS）和 人 工 合 成 類 似 物（GR24）正離子模式下高分辨串聯(lián)質(zhì)譜可能的碎裂規(guī)律，為進一步篩選和驗證植物內(nèi)源性SLs類化合物提供借鑒和幫助。

圖1 3種代表性獨角金內(nèi)酯化合物的結構式Fig.1 The structures of 3representative model compounds of strigolactones

1 實驗部分

1.1 儀器及實驗條件

12TsolariX傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀（FTICR MS）：德國Bruker Daltonics公司產(chǎn)品，直接進樣方式。

質(zhì)譜條件：樣品流速2μL／min；毛細管噴霧電壓4 500V；末端板補償電壓－500V；干燥氣流速4.0L／min；霧化氣壓力100kPa；源溫200℃；掃描區(qū)間m／z50～400；離子選擇模式sweep；選擇離子窗口寬度0.5u；串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)均在離子回旋池中進行采集（in cell模式），碰撞誘導解離模式為SORI CID，能量選擇區(qū)間1%～2%。

1.2 主要材料與試劑

乙腈、超純水：德國Fluka Diesenhofen公司產(chǎn)品；Strigol、5－Deoxystrigol：捷 克 OlChemIm Ltd公司產(chǎn)品；GR24：荷蘭Chiralix BV公司產(chǎn)品。考慮到獨角金內(nèi)酯類化合物在質(zhì)子化溶劑條件下的穩(wěn)定性較差，首先將上述標準品溶解于乙腈中，配制成500μg／L儲備液，備用。為獲得穩(wěn)定電噴霧離子化響應信號，將上述儲備液用75%乙腈水溶液稀釋至500ng／L，用于FTICR MS直接進樣分析。

2 結果與討論

實驗中選擇的SLs模型化合物具有此類化合物的代表性：GR24是A環(huán)為苯環(huán)的人工合成類似物，其合成成本相對較低，常用于替代昂貴的植物內(nèi)源性SLs化合物，對SLs合成或信號途徑發(fā)生突變的植物樣本進行遺傳學研究；Strigol和5－DS是分布廣泛的獨角金內(nèi)酯類化合物，已被發(fā)現(xiàn)存在于多個物種中。依據(jù)SLs化合物的A／B環(huán)結構特征，可將目前已發(fā)現(xiàn)的獨角金內(nèi)酯類化合物區(qū)分為A環(huán)或B環(huán)羥基化和未羥基化兩大類，因此本實驗分別選擇Strigol和5－DS作為上述兩類SLs類化合物的模型化合物，重點探討其串聯(lián)質(zhì)譜碎裂特征，為后期新型SLs類化合物的發(fā)現(xiàn)和定性表征提供借鑒和幫助。

2.1 SLs類化合物MS／MS中D環(huán)子離子特征

GR24、5－DS和Strigol的二級質(zhì)譜圖示于圖2a，由圖2a可見，上述3種化合物均能夠產(chǎn)生m／z97.028 4的子離子，其途徑是連接C環(huán)和D環(huán)的烯醚鍵發(fā)生斷裂，產(chǎn)生D環(huán)碎片離子所致。D環(huán)子離子的產(chǎn)生不受ABC環(huán)的結構形式影響，羥基化或具有苯環(huán)結構特征A環(huán)的Strigol和GR24均能夠產(chǎn)生D環(huán)碎片子離子，實驗結果與部分文獻具有一致性［17－20］。因此可以考慮在后續(xù)SLs類化合物篩選時，將其作為特征離子加以關注。

2.2 SLs類化合物MS／MS中H2O及CO中性丟失碎裂途徑分析

值得注意的是，3種SLs模型化合物MS／MS譜中均有多重H2O及CO中性碎片丟失子離子產(chǎn)生。除［M＋H］＋能夠直接產(chǎn)生的多重H2O及CO中性碎片丟失子離子外，MS／MS譜中還能夠發(fā)現(xiàn)明顯的ABC環(huán)失去H2O及CO中性碎片丟失子離子，例如［ABC＋HH2O］＋、［ABC＋H－2H2O］＋和［ABC＋HH2O－CO］＋等子離子，其歸屬信息列于表1。這些子離子的產(chǎn)生與SLs類化合物分子結構中的A環(huán)、C環(huán)和D環(huán)密切相關。其中，Stigol的5－OH是H2O中性碎片丟失的典型結構特征，因此其［M＋H－H2O］＋易于歸屬，脫水后的A環(huán)能夠形成雙烯共軛結構特征的子離子；而5－DS和GR24沒有羥基修飾，其H2O和CO中性碎片丟失碎裂途徑與具有羥基的SLs類化合物不同。根據(jù)文獻報道，具有內(nèi)酯結構特征的離子在碰撞誘導解離（CID）過程中，能夠發(fā)生H2O中性碎片丟失現(xiàn)象［21］。SLs類化合物其分子的C環(huán)和D環(huán)分別是丁酸內(nèi)酯和丁烯酸內(nèi)酯結構，其內(nèi)酯結構的醇羥基O具有較強的質(zhì)子親和勢，質(zhì)子化后的丁酸內(nèi)酯和丁烯酸內(nèi)酯發(fā)生開環(huán)裂解，同時，羰基的β位H通過重排轉(zhuǎn)移至質(zhì)子化的醇羥基，進而發(fā)生H2O和CO中性碎片丟失，其碎裂機理示于圖2b。綜合2.1和2.2的分析結果，SLs類化合物可能發(fā)生碰撞誘導解離的化學鍵位置示于圖2c。

2.3 SLs類化合物 MS／MS中自由基子離子特征

盡管SLs類化合物不具備大共軛體系，但在其串聯(lián)質(zhì)譜信息中仍能發(fā)現(xiàn)典型的自由基子離子，例如5－DS譜圖中的m／z234.125 05、m／z216.114 48 等，GR24MS／MS 譜 圖 中 的m／z202.062 43。這些子離子均產(chǎn)生自D環(huán)中性碎片丟失，同時，對應于這些ABC環(huán)自由基子離子碎片，還有相應的D環(huán)、H2O和CO同時失去的子離子，如表1中所總結的［ABC＋HH2O］＋·、［ABC＋H－2H2O］＋和［ABC＋HH2O－CO］＋。說明SLs類化合物在發(fā)生D環(huán)中性丟失過程中，化學鍵的裂解主要是通過均裂產(chǎn)生，同時，得到的自由基子離子能夠被C環(huán)的內(nèi)酯羰基和α位的烯鍵共軛穩(wěn)定，形成豐度較高的奇電子離子，而這些自由基子離子能夠進一步發(fā)生更為復雜的碰撞誘導解離。以最具生物活性的水稻內(nèi)源性SLs類化合物5－DS為例，其m／z234.125 05的［ABC＋H］＋·自由基子離子的MS／MS／MS三級質(zhì)譜圖示于圖3a。

圖2 GR24、5－DS和Strigol二級質(zhì)譜圖及可能的碎裂機理Fig.2 The MS／MS mass spectra of GR24，5－DS and Strigol and proposed fragmentation pathway

表1 3種SLs類化合物MS／MS子離子類別及對應質(zhì)荷比信息Table 1 The category of SLs’fragment ions and corresponding mass to charge（m／z）information

圖3 5－DS自由基子離子［ABC＋H］＋·的三級質(zhì)譜圖及可能的碎裂途徑Fig.3 The MS3 spectra of radical fragment ion［ABC＋H］＋and proposed fragmentation pathway

5－DS自由基離子［ABC＋H］＋的三級質(zhì)譜表明，其三級子離子能夠通過CH3中性碎片丟失碎裂途徑得到更為穩(wěn)定的偶電子三級子離子［ABC＋H－H2O－CH3］＋（m／z201.090 89），由于［ABC＋H］＋具有完整的ABC環(huán)結構，仍具備丁酸內(nèi)酯結構特征，因此能夠產(chǎn)生［ABC＋H－H2O］＋（m／z216.114 36）和［ABC＋HH2O－CO］＋（m／z173.095 99）三級子離子，進一步驗證了SLs類化合物 MS／MS中H2O及CO中性丟失碎裂途徑的分析結果。同時，在［ABC＋H］＋·的三級質(zhì)譜圖的低質(zhì)量端，有較多具有多共軛結構特征的AB環(huán)三級子離子產(chǎn)生。其 中，m／z145 的 譜 峰 由 ［C10H9O］＋和［C11H13］＋兩組碎片離子組成；m／z131的譜峰由［C9H7O］＋和［C10H11］＋兩組碎片離子組成，示于圖3a。上述兩組碎片離子的質(zhì)荷比相差0.03u左右，得益于傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀的超高分辨率能夠?qū)ζ溥M行清晰區(qū)分，這些三級子離子進一步顯示出自由基子離子發(fā)生碰撞誘導解離時其碎裂途徑更為復雜，示于圖3b。而低質(zhì)量區(qū)豐富的碎片離子信息為SLs類化合物的定性表征提供了可靠數(shù)據(jù)保證。

3 結論

實驗結果表明，傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜能夠提供精準的串聯(lián)質(zhì)譜表征數(shù)據(jù)，初步闡述了SLs類化合物的質(zhì)譜碎裂特征，盡管單純依賴質(zhì)譜手段還不能夠?qū)Ls類化合物進行完全的結構確認，其串聯(lián)譜圖中D環(huán)、H2O和CO等特征中性丟失途徑和ABC環(huán)形成的自由基子離子，為后期開展植物內(nèi)源性SLs類化合物結構定性研究和利用三重四極桿質(zhì)譜儀進行此類化合物定量分析MRM通道選擇奠定了基礎。本工作就具有特征內(nèi)酯結構形式的植物激素的H2O和CO中性丟失的機理進行了探討，為具有類似結構特征的天然產(chǎn)物質(zhì)譜分析提供借鑒。

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