周貽兵，吳 坤，劉利亞，王婭芳，李 磊，林 野

（1.貴州省疾病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽 550004；2.貴州師范學(xué)院，貴州 貴陽 550018）

孔雀石綠（malachite green，MG）和結(jié)晶紫（crystal violet，CV）均屬于堿性三苯甲烷類染料。MG與CV能夠阻礙蛋白肽的形成，抑制細胞分裂，從而產(chǎn)生良好的抗菌和殺菌作用，因殺菌效果較好、價廉、易得等優(yōu)點，作為化學(xué)消毒劑曾被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病的防治。魚暴露在含有MG或CV的水中，MG和CV會迅速被魚類吸附且富集在肌肉中，并在組織中很快代謝為危害性更強的隱色孔雀石綠（leucomalachite green，LMG）和隱色結(jié)晶紫（leucocrystal violet，LCV），而代謝物在肌肉組織中的殘留時間較長。MG和CV及其代謝物具有高毒、高殘留和致癌、致畸、致突變等特點［1－7］。歐美、日本等國家已宣布嚴禁在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用孔雀石綠和結(jié)晶紫，并規(guī)定水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫不得檢出。2002年5月我國農(nóng)業(yè)部將其列入《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》中，禁止用于所有食品動物，但非法使用屢禁不止。

目前，魚中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物的測定方法有高效液相色譜法、氣相色譜－質(zhì)譜法、高效液相色譜－質(zhì)譜法、高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法、共振瑞利散射法、薄層色譜法、分光光度法等［8－12］。氣相色譜－質(zhì)譜法僅能測定隱性孔雀石綠；液相色譜－質(zhì)譜法需要特殊的柱后衍生設(shè)備，可能會引起峰展寬、降低靈敏度，同時衍生化試劑也可能對分離造成干擾；薄層色譜法、分光光度法等操作過程繁瑣，易造成假陽性。魚樣品的基質(zhì)較為復(fù)雜，易造成基質(zhì)抑制效應(yīng)，可通過穩(wěn)定性同位素稀釋技術(shù)、基質(zhì)匹配標(biāo)準曲線和選擇較優(yōu)的樣品凈化技術(shù)來解決。本研究在樣品中加入同位素內(nèi)標(biāo)，采用超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC－MS／MS）法同時測定魚樣品中 MG、LMG、CV、LCV殘留，并對大批次魚樣的肌肉組織進行檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Ultimate 3000超高壓液相色譜儀，TSQ Quantum ultra三重四極桿質(zhì)譜儀：美國Thermo－Fisher世爾科技有限公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源（ESI）；Sigma臺式高速離心機；TTL－DCⅡ型氮吹儀；艾科浦超純水機；中性氧化鋁固相萃取小柱（6mL／1g）。

孔雀石綠、隱色孔雀石綠標(biāo)準品（100mg／L）：購自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研所；結(jié)晶紫標(biāo)準品（純度＞98.9%）、隱色結(jié)晶紫（純度＞99.7%）：購自中國計量科學(xué)研究院；D5－孔雀石綠苦味酸鹽標(biāo)準品和D5－隱色孔雀石綠標(biāo)準品（純度＞99.7%）：購自Sigma公司；醋酸銨（分析純），乙腈（色譜純），甲酸（色譜純）：購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

標(biāo)準溶液的配制：分別準確稱取適量的結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫、D5－隱色孔雀石綠和D5－孔雀石綠苦味酸（折算成D5－孔雀石綠）標(biāo)準品，用乙腈配制成1 000mg／L標(biāo)準貯備液；將標(biāo)準貯備液（CV、LCV、D5－MG、D5－LMG）和 MG、LMG（100mg／L）用乙腈稀釋成10mg／L標(biāo)準中間液和內(nèi)標(biāo)中間液；分別取適量的標(biāo)準中間液和內(nèi)標(biāo)中間液，用乙腈稀釋成100μg／L標(biāo)準使用液。

1.2 樣品處理

1.2.1 樣品的制備與提取 從市場上購買不同品種的活魚，經(jīng)剖殺去除頭、骨、內(nèi)臟，將肉切成塊狀，用電動絞肉機打成漿狀，于－20℃保存，待測。

將魚樣解凍，準確稱取5g（精確到0.1g）均勻樣品于50mL塑料離心管中，添加100μL混合同位素內(nèi)標(biāo)使用液，加入25mL乙腈，旋渦混勻器上混勻，以10 000r／min離心10min，收集上清液于玻璃管中，待凈化。

1.2.2 樣品凈化 用5mL乙腈活化中性氧化鋁小柱，取5mL上清液于中性氧化鋁小柱上，用10mL玻璃試管收集濾液，再用5mL乙腈淋洗小柱，將收集的濾液和淋洗液混合，40℃下氮吹至近干，用V（乙腈）∶V（5mmol／L醋酸銨）＝50∶50的溶液溶解殘渣，過0.22μm濾膜，液質(zhì)聯(lián)用儀檢測。

1.3 實驗條件

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Hypersil Gold－C18柱（150mm×2.1mm×1.9μm）；柱溫30℃；進樣體積10μL；流動相：5mmol／L乙酸銨（用乙酸調(diào)節(jié)pH 4.5）和乙腈；流速0.4mL／min；梯度洗脫條件列于表1。

1.3.2 質(zhì)譜條件 ESI（＋）離子源，噴霧電壓3 000V，毛細管溫度350℃，蒸發(fā)溫度450℃，鞘氣壓力276kPa，輔助氣壓力104kPa，碰撞氣（Ar）壓力0.2Pa，SRM 優(yōu)化參數(shù)列于表2。

表1 梯度洗脫條件Table 1 The conditions of gradient elution

表2 質(zhì)譜參數(shù)Table 2 MS parameters

2 結(jié)果與討論

2.1 提取與凈化

MG、CV在魚肌肉組織中很快代謝為LMG、LCV，隱色代謝物具有很好的親脂性，魚肌肉樣品基質(zhì)化學(xué)成分復(fù)雜，其中脂肪的存在不利于目標(biāo)物的提取與凈化，在測定過程中易產(chǎn)生離子抑制效應(yīng)，所以應(yīng)設(shè)法去除脂肪以提高離子化效率和儀器的靈敏度。去除樣品中的脂肪常用氧化鋁（酸性氧化鋁、中性氧化鋁、堿性氧化鋁）［13－14］，在非極性溶劑乙腈中，用乙腈活化過的酸性氧化鋁和中性氧化鋁對目標(biāo)化合物的吸附能力很弱，而堿性氧化鋁對MG有一定的吸附，所以本實驗選擇的中性氧化鋁能有效的去除脂肪且減少目標(biāo)化合物的吸附。在樣品提取和凈化過程中，微量的LMG、LCV被氧化為MG、CV，文獻報道［15］加入還原能力更強的物質(zhì)能有效防止這種情況的發(fā)生，而本實驗則采用加入穩(wěn)定性同位素內(nèi)標(biāo)物質(zhì)來提高測定的準確性。

2.2 LC－MS／MS分析

通過ESI正離子模式對4種目標(biāo)化合物及2種內(nèi)標(biāo)化合物進行全掃描，找出準分子離子峰［M＋H］，并且以此準分子離子峰為母離子進行轟擊和二級質(zhì)譜掃描，找出2個信號較強的碎片離子構(gòu)成監(jiān)測離子對（表2）。結(jié)晶紫碎片離子的質(zhì)譜圖示于圖1，可以看出，結(jié)晶紫m／z340和356兩個碎片離子的響應(yīng)信號較強，以這兩個碎片離子和準分子離子峰構(gòu)成監(jiān)測離子對。改變透鏡電壓使母離子最大效率的通過一級質(zhì)譜進入二級質(zhì)譜進行碰撞，對碎片離子的碰撞能量進行優(yōu)化，提高碎片離子的響應(yīng)強度。結(jié)晶紫準分子離子透鏡電壓優(yōu)化曲線和碎片離子碰撞能量優(yōu)化曲線示于圖2。

在流動相中加入適量的甲酸、乙酸和低濃度的揮發(fā)性緩沖鹽在離子化過程中得到更加豐富的離子碎片信息，改善峰形，提高測定的靈敏度，本實驗在流動相水中加入5mmol／L醋酸銨，用乙酸調(diào)節(jié)pH 4.5，獲得良好的效果。以SRM模式對待測物進行定性定量分析，混合標(biāo)準溶液SRM圖示于圖3。

圖1 結(jié)晶紫準分子離子（a）和碎片離子（b）質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectrometer of quasi－molecular（a）and fragment（b）ions of CV

圖2 結(jié)晶紫準分子離子透鏡電壓（a）和碎片離子碰撞能量優(yōu)化曲線（b）Fig.2 Optimizing curves of quasi－molecular ion tube lens（a）and fragment ion collision energy（b）of CV

圖3 混合標(biāo)準溶液的提取離子色譜圖Fig.3 Ion chromatogram of extract in mixed standard solution

2.3 工作曲線和檢出限

取100μg／L混合標(biāo)準工作液和混合同位素內(nèi)標(biāo)工作液，用V（乙腈）∶V（5mmol／L醋酸銨）＝50∶50的溶液配制成0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0μg／L系列濃度溶液，其中內(nèi)標(biāo)含量均為2.0μg／L，按1.3進行測定。分別用 MG、CV的峰面積與D5－MG的峰面積比值和LMG、LCV的峰面積與D5－LMG的峰面積比值為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制工作曲線。MG：y＝0.219 7x－0.011 1（r2＝0.999 1）；CV：y＝0.245 7x－0.006 4（r2＝0.999 6）；LMG：y＝0.443 7x－0.011 4（r2＝0.999 6）；LCV：y＝0.083 8x＋0.004 1（r2＝0.999 3）。以各目標(biāo)物在空白樣品中的S／N＝3計算該方法的檢出限，MG、LMG、CV 檢出限為 0.01 μg／kg，LCV檢出限為0.06μg／kg。

2.4 方法的回收率及精密度實驗

在空白樣品中分別添加0.25、2.0μg／kg混合標(biāo)準溶液和2.0μg／kg內(nèi)標(biāo)溶液，充分混勻，放置過夜吸收，按1.2方法提取、凈化、上機測定，回收率及精密度列于表3。

表3 回收率及精密度實驗結(jié)果（n＝6）Table 3 The results of recoveries and precision

2.5 實際樣品的測定

應(yīng)用此方法檢測市售的109批魚樣品，其中孔雀石綠陽性樣品1份，含量為0.57μg／kg；隱色孔雀石綠陽性樣品15份，含量在0.65～10.6 μg／kg之間；結(jié)晶紫陽性樣品5份，含量在0.56～1.19μg／kg之間；隱性結(jié)晶紫陽性樣品1份，含量為0.65μg／kg。結(jié)果表明，市售的魚樣品中仍然存在濫用孔雀石綠和結(jié)晶紫的情況。

3 結(jié)論

本研究建立了UPLC－MS／MS測定魚樣品中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物殘留量的方法。樣品中MG、CV及其代謝物直接用乙腈提取，簡化了樣品前處理步驟，同時加入穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)進行校正，降低基質(zhì)抑制效應(yīng)。在空白樣品中加入兩個濃度水平的標(biāo)準溶液，回收率、精密度良好，檢出限低。該方法能夠靈敏、準確、可靠的測定魚中MG、CV及其代謝物殘留，為魚類水產(chǎn)品養(yǎng)殖、流通和使用環(huán)節(jié)的市場監(jiān)管提供參考依據(jù)。

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