張亞雙， 閔春艷

（蘇州市藥品檢驗(yàn)所，江蘇蘇州 215104）

小活絡(luò)丸中非法添加松香酸的檢查方法研究

張亞雙， 閔春艷*

（蘇州市藥品檢驗(yàn)所，江蘇蘇州 215104）

目的 建立小活絡(luò)丸中非法添加松香酸的HPLC檢查法，并以HPLC/MS法加以驗(yàn)證。方法 選用Waters Symmetry C18（5 μm，4.6 mm ×250 mm）；Inertsil ODS-3（5 μm，4.6 mm ×250 mm）；TURNER C18（100A，5 μm，4.6 mm×250 mm）3三種色譜柱，二極管陣列檢測器 （PDA），乙腈－0.1%甲酸溶液 （75∶25）為流動相等度洗脫，柱溫20℃，體積流量1 mL/min，檢測波長241 nm（190～300 nm）。通過比對供試品與對照品HPLC色譜及光譜，對小活絡(luò)丸中是否非法添加松香酸作定性分析。結(jié)果 小活絡(luò)丸供試品中均檢出松香酸。結(jié)論 本方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好，操作簡單，可用于小活絡(luò)丸中非法添加松香酸的定性檢查。

小活絡(luò)丸；松香酸；高效液相色譜；二極管陣列檢測器

小活絡(luò)丸方劑中有制川烏、制草烏、膽南星、乳香（制）、沒藥、地龍，載于宋代《太平惠民和劑局方》，有祛風(fēng)散寒除濕、化痰、活血功效，用于治療風(fēng)寒濕痹所引起的經(jīng)絡(luò)不通，肢體關(guān)節(jié)疼痛，關(guān)節(jié)屈伸不利、麻木拘攣，及中風(fēng)手足不仁等癥［1］，此外有研究表明小活絡(luò)丸還具有較強(qiáng)的抗炎、鎮(zhèn)痛作用［2］。

方中乳香、沒藥富含揮發(fā)油［3］，二藥并用為宣通臟腑，流通經(jīng)絡(luò)之要藥，主產(chǎn)于索馬里、埃塞俄比亞、利比亞、蘇丹、土耳其等國家［4］，國內(nèi)對其療效及活性成分進(jìn)行了大量研究。近年來隨著藥材價(jià)格上漲，市場上出現(xiàn)了乳香、沒藥的偽藥及劣藥，如摻石膏粉等，楊秀澤等研究了其相應(yīng)的鑒別方法［5-6］，其中摻入松香的乳香沒藥偽品引起了我們的注意，松香的主要成分為松香酸酐和游離松香酸，有小毒［7］。有報(bào)道稱，銀屑敵膠囊因非法添加松香酸而導(dǎo)致服用者視力下降、死亡等嚴(yán)重后果。夏小中等研究了藥材中非法添加松香的理化及薄層色譜鑒別方法［8］，李麗在麝香接骨膠囊中檢出松香酸并建立了相應(yīng)的HPLC檢查法［9］。小活絡(luò)丸中乳香、沒藥經(jīng)過炮制和粉碎，理化鑒別效果不佳，薄層色譜鑒別中檢出可疑斑點(diǎn)，疑為松香酸，因此建立了HPLC法檢測小活絡(luò)丸中非法添加的松香酸，采用二極管陣列檢測器 （PDA）確定結(jié)果，采用UPLC-MS加以驗(yàn)證［10］。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 SHIMADZU LC-20AD SlutionHPLC，二極管陣列檢測器，METTLER TOLEDO電子天平。

1.2 試藥 松香酸由A Johnson Matthey公司提供，批號為42582，小活絡(luò)丸供試品為 A公司 （大蜜丸）批號101002、B公司 （濃縮丸）批號62101204及C公司 （濃縮丸）批號10C10。乙腈 （色譜純，TEDIA公司），甲酸（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），水為超純水。

2 實(shí)驗(yàn)條件與方法學(xué)考察

2.1 色譜條件［11］Waters Symmetry C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；Inertsil ODS-3（5 μm，4.6 mm × 250 mm）；TURNER C18100A（5 μm，4.6 mm×250 mm）3種色譜柱，二極管陣列檢測器，乙腈－0.1%甲酸溶液 （75∶25）為流動相等度洗脫，柱溫20℃，體積流量1 mL/min，檢測波段為190～300 nm（色譜提取波長為241 nm），進(jìn)樣量為10 μL。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取松香酸對照品10 mg置10 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取小活絡(luò)丸供試品大蜜丸3丸，加硅藻土適量，碾勻研細(xì)或取濃縮丸10丸研細(xì)，置錐形瓶中，加甲醇35 mL，超聲處理30 min（250 W，33 kHz），離心，取上清液，0.45 μm濾膜濾過，即得。

2.4 陰性干擾考察 取不含松香酸的的陰性樣品 （按供試品制備方法制備），采用 TURNER C18100A（5 μm，4.6 mm×250 mm）色譜柱依法測定，結(jié)果陰性樣品在松香酸峰相應(yīng)位置上無吸收峰，表明小活絡(luò)丸的方劑中的藥物組分對松香酸的測定無干擾，見圖1。

圖1 松香酸對照品 （A）、檢出松香酸小活絡(luò)丸樣品 （B）及不含松香酸樣品 （C）HPLC色譜圖

2.5 方法耐用性考察 選取不同型號的色譜柱：（031號柱）Waters Symmetry C18（5 μm，4.6 mm × 250 mm）；（032 號柱）Inertsil ODS-3（5 μm，4.6 mm × 250 mm）；（075 號柱）TURNER HPLC Columns C18（5 μm，4.6 mm ×200 mm），按上述測定法測定A公司生產(chǎn)小活絡(luò)丸 （大蜜丸，批號：101201）供試品溶液。松香酸特征峰分離度良好，能滿足實(shí)驗(yàn)要求，方法耐用性好，見圖2。

圖2 小活絡(luò)丸中松香酸系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

2.6 線性關(guān)系考察 取松香酸對照品6.41 mg，置5 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別取1、3、7、10、15、20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以各自的峰面積對其注入質(zhì)量數(shù) （mg）進(jìn)行線性回歸，回歸方程為Y=155 073.0 X －90 461.99，R2=0.999 9，結(jié)果表明在1.153 8～23.076 μg范圍內(nèi)，松香酸峰面積與其質(zhì)量呈良好線性關(guān)系。

2.7 定量限 將1.153 8 mg/mL的對照品溶液分別以1、3、5、7、10、15、20 μL進(jìn)樣，根據(jù)峰高以信噪比 S/N=10確定松香酸的定量限為26.809 μg。

2.8 檢測限 同定量限測定方法，根據(jù)峰高以信噪比S/N=3確定松香酸的檢測限為8.847 μg。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

取3個(gè)不同廠家生產(chǎn)的小活絡(luò)丸供試品，按2.3項(xiàng)供試品溶液制備方法制備，精密吸取供試品溶液及對照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，采用TURNER C18100A（5 μm 4.6 mm×250 mm）色譜柱按2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測定，測定結(jié)果見表1，松香酸對照品與3批供試品的HPLC圖譜及相應(yīng)光譜圖見圖3。

表1 小活絡(luò)丸中非法添加松香酸測定結(jié)果

圖3 小活絡(luò)丸中非法添加松香酸HPLC圖譜及相應(yīng)光譜圖

4 小活絡(luò)丸中非法添加松香酸的質(zhì)譜驗(yàn)證

4.1 試驗(yàn)儀器 Waters ACQUITY UPLC Xevo TQ液質(zhì)聯(lián)用色譜儀

4.2 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動相為0.1%甲酸溶液（A）；0.1%甲酸乙腈 （B）溶液按表2梯度洗脫。

表2 小活絡(luò)丸中松香酸液質(zhì)聯(lián)用分析流動相梯度洗脫

質(zhì)譜條件：離子化模式ESI+；毛細(xì)管電壓3.0 KV；源溫度150℃；脫溶劑氣溫度500℃；霧化氣體積流量900 L/h；采集參數(shù)如表3所示。

表3 小活絡(luò)丸中松香酸質(zhì)譜分析采集參數(shù)表

4.3 質(zhì)譜驗(yàn)證結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 （UPLC-MS）技術(shù)對上述松香酸檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，利用液相保留時(shí)間 （RT=1.79min）和松香酸正離子（［M+1］+=303.17）模式下不同碰撞能量產(chǎn)生的3個(gè)特征子離子 （257.21，123.12和105.04）來判斷是否含有松香酸，UPLC-MS具有高效、精確、分離效果好等優(yōu)點(diǎn)［12］，結(jié)果顯示能夠?qū)λ上闼徇M(jìn)行定性定量驗(yàn)證。結(jié)果如表4及圖4～圖7所示，供試品中均檢出與松香酸對照品相同的3個(gè)特征子離子，即檢出松香酸。

表4 小活絡(luò)丸中非法添加松香酸的質(zhì)譜檢測結(jié)果

圖4 松香酸對照品質(zhì)譜圖

圖5 小活絡(luò)丸 （A公司生產(chǎn)）質(zhì)譜圖

5 討論

通過實(shí)驗(yàn)得知當(dāng)前原料藥材的控制存在一定問題，添加有松香酸的乳香沒藥等藥材已經(jīng)流入中成藥生產(chǎn)領(lǐng)域，從而導(dǎo)致中成藥中含有松香酸，除了在原料藥材上加強(qiáng)把關(guān)力度外，在含有乳香沒藥等藥材的中成藥標(biāo)準(zhǔn)中增加松香酸非法添加的檢查法也已經(jīng)迫在眉睫。

質(zhì)譜驗(yàn)證結(jié)果表明目前所建立的小活絡(luò)丸中非法添加松香酸HPLC檢查法結(jié)果準(zhǔn)確、方法可行，可以作為小活絡(luò)丸標(biāo)準(zhǔn)中松香酸的檢查法對其進(jìn)行有效控制，具有較強(qiáng)的現(xiàn)實(shí)意義。

圖6 小活絡(luò)丸 （B公司生產(chǎn)）質(zhì)譜圖

圖7 小活絡(luò)丸 （C公司生產(chǎn)）質(zhì)譜圖

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［11］國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品檢驗(yàn)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目批準(zhǔn)件2011005（乳香）［S］.

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R927.1

B

1001-1528（2013）04-0867-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2013.04.059

2012-05-07

張亞雙 （1981—），女，主管中藥師，研究方向：中藥飲片真?zhèn)舞b定、中成藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升。Tel：（0512）68223525，E-mail：ysz3366@126.com

*通信作者：閔春艷 （1979—），女，主管中藥師，研究方向：中藥質(zhì)量控制。Tel：（0512）68223525，E-mail：minchunyan0609@hotmail.com