王恩軍， 劉紅霞， 黨志勇， 靳 祎， 郭曉軍， 李術(shù)娜， 李 錦

（1.河北大學(xué)，河北保定071000；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，河北保定071000；3.秦皇島市中醫(yī)院，河北 秦皇島 066000）

箬葉多糖對(duì)乳腺癌免疫抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究

王恩軍1， 劉紅霞1， 黨志勇1， 靳 祎1， 郭曉軍2， 李術(shù)娜2， 李 錦3

（1.河北大學(xué)，河北保定071000；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，河北保定071000；3.秦皇島市中醫(yī)院，河北 秦皇島 066000）

目的 觀察箬葉多糖對(duì)移植性乳腺癌荷瘤小鼠的抑制作用及免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。方法 采用TA2小鼠的乳腺癌MA737細(xì)胞移植模型，設(shè)正常組、腫瘤模型組、陽性對(duì)照組 （環(huán)磷酰胺 25 mg/kg）、箬葉多糖高劑量組 （200 mg/kg）、箬葉多糖中劑量組 （100 mg/kg）、箬葉多糖低劑量組 （50 mg/kg）及箬葉多糖中劑量組 （100 mg/kg）聯(lián)合環(huán)磷酰胺 （25 mg/kg）組，通過瘤質(zhì)量測(cè)定箬葉多糖體內(nèi)抗乳腺癌活性，并通過淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)、巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)測(cè)定荷瘤小鼠淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞功能的變化。結(jié)果 箬葉多糖中、高劑量組及箬葉多糖聯(lián)合環(huán)磷酰胺組灌胃處理后，一般情況有所改善，瘤質(zhì)量減輕，增加小鼠脾指數(shù) （P＜0.05），并促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，提高巨噬細(xì)胞的吞噬能力 （P＜0.05）。結(jié)論 箬葉多糖對(duì)體內(nèi)乳腺癌小鼠具有很好的抑制作用，并能增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，且與環(huán)磷酰胺合用時(shí)還有增效減毒的作用。

箬葉多糖；乳腺癌；免疫；抑制作用；MA737

箬葉是禾本科植物箬竹Indocalamus tessellatus（Munro）Keng f.的葉，有特殊清香氣味，葉片寬大，常用來包粽子。《本草綱目》中記載其性味甘、寒，歸肺、肝經(jīng)，有清熱止血、解毒消腫、治衄血、便血、崩漏、喉痹等功效［1-3］，現(xiàn)代藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明箬葉具有抗炎、防腐、抗?jié)?、抗艾滋病病毒及抗腫瘤等作用［4-6］。箬葉中含有多糖、茶多酚、氨基酸、維生素等成分。近些年，越來越多的研究表明多糖對(duì)人體具有極大的利用價(jià)值，本實(shí)驗(yàn)采用TA2小鼠的乳腺癌MA737細(xì)胞移植模型，對(duì)箬葉多糖體內(nèi)抗乳腺癌活性及機(jī)制進(jìn)行了研究，為將其開發(fā)為臨床抗癌輔助藥物提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與藥品箬葉購(gòu)于江西省九江市，經(jīng)河北大學(xué)中醫(yī)學(xué)院梁先茂副教授鑒定為禾本科植物箬竹的葉；刀豆素蛋白 （ConA）及四甲基偶氮唑鹽 （MTT）購(gòu)自Sigma公司，環(huán)磷酰胺購(gòu)自山西普德藥業(yè) （批號(hào)20081023），RPMI-1640培養(yǎng)基及二甲基亞砜 （DMSO）購(gòu)自GIBCO公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與腫瘤細(xì)胞株 健康TA2小鼠，4～5周齡，20～24 g，雌性，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院提供。瘤株：MA737小鼠乳腺癌細(xì)胞株，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物制藥系惠贈(zèng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 箬葉多糖的提取 提取方法為熱水浸提法，經(jīng)苯酚-硫酸法測(cè)定，其多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為49.08%。

1.3.2 建立小鼠乳腺癌模型 處死荷瘤種鼠，在無菌條件下取2～3 mm瘤組織塊 （約含3×106個(gè)MA737細(xì)胞），植于小鼠右側(cè)背部皮下，建立小鼠乳腺癌實(shí)體瘤模型。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 將接種72 h后的小鼠48只隨機(jī)分為6組，每組8只。實(shí)驗(yàn)設(shè)腫瘤模型組 （生理鹽水）、陽性對(duì)照組 （環(huán)磷酰胺 25 mg/kg）、箬葉多糖低劑量組（50 mg/kg）、中劑量組 （100 mg/kg）、高劑量組 （200 mg/kg）、箬葉多糖中劑量 （100 mg/kg）聯(lián)合環(huán)磷酰胺（25 mg/kg）組，另取8只未接種小鼠作為正常對(duì)照組 （蒸餾水）。蒸餾水、生理鹽水、箬葉多糖采用灌胃給藥，環(huán)磷酰胺采用皮下給藥，均為每天1次，劑量為0.1 mL/10 g，連續(xù)14 d。每日記錄各組小鼠的飲食、毛發(fā)、活動(dòng)、精神狀態(tài)等體征。

1.3.4 腫瘤抑制率和脾臟指數(shù)的測(cè)定 末次給藥后24 h處死小鼠，稱定質(zhì)量。剖取各組小鼠的腫瘤組織及脾臟，并稱定質(zhì)量，計(jì)算小鼠的腫瘤抑制率和脾臟指數(shù)。

腫瘤抑制率 （%）=（1－給藥組平均瘤質(zhì)量/對(duì)照組平均瘤質(zhì)量）×100%

脾臟指數(shù) （mg/10 g）=（脾臟質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量）×10

1.3.5 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn) 采用MTT法，參考文獻(xiàn)［7］在無菌條件下摘取脾臟，制成脾細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL的懸液，并加入到培養(yǎng)板中，每孔100 μL，隨后加入終質(zhì)量濃度5 μg/mL的ConA溶液100 μL，并設(shè)相應(yīng)對(duì)照孔。于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68 h，各孔加入MTT（5 mg/mL）液20 μL，再培養(yǎng)4 h，離心棄上清，各孔加入DMSO溶解，酶標(biāo)儀測(cè)定A值 （波長(zhǎng)為570 nm）。

1.3.6 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn) 參照文獻(xiàn) ［8-9］，小鼠分組及給藥情況同上。小鼠預(yù)先在試驗(yàn)前72 h腹腔內(nèi)注射淀粉肉湯培養(yǎng)基，試驗(yàn)當(dāng)天，在腹腔內(nèi)注射Hank's液后輕揉腹部，隨后處死小鼠，收集腹腔內(nèi)混勻的液體。取2～3滴于載玻片上，加等量的雞紅細(xì)胞懸液混勻。置于37℃水浴，用生理鹽水漂洗后干燥，瑞氏染色，觀察巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞情況，計(jì)算吞噬指數(shù)及吞噬百分率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示。組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察結(jié)果 正常對(duì)照組小鼠飲食正常，無明顯增減，毛發(fā)有光澤，精神狀態(tài)良好，活躍。腫瘤模型組小鼠在給藥后期出現(xiàn)飲食量減少，毛發(fā)無光澤，精神萎靡，活動(dòng)量減少。箬葉多糖中、高劑量組和箬葉多糖聯(lián)合環(huán)磷酰胺組小鼠飲食、毛發(fā)、精神狀態(tài)和活動(dòng)情況與正常對(duì)照組比較無明顯變化，僅有個(gè)別小鼠在給藥后期因腫瘤增大影響活動(dòng)。

2.2 對(duì)荷瘤小鼠抑瘤率和脾臟指數(shù)的影響 100 mg/kg，

200 mg/kg箬葉多糖組瘤質(zhì)量均低于腫瘤模型組，抑瘤率隨劑量的增加而增強(qiáng)；同時(shí)與腫瘤模型組相比，100 mg/kg，200 mg/kg箬葉多糖可顯著提高小鼠脾臟指數(shù) （P＜0.05）。箬葉多糖與環(huán)磷酰胺聯(lián)合使用，與環(huán)磷酰胺組相比，瘤質(zhì)量降低，脾臟指數(shù)增加 （P＜0.05）。見表1。

表1 箬葉多糖對(duì)荷瘤小鼠體質(zhì)量、瘤質(zhì)量、抑瘤率及脾指數(shù)的影響

2.3 對(duì)荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞功能的影響 腫瘤模型組小鼠T淋巴細(xì)胞增殖明顯低于正常對(duì)照組 （P＜0.01），經(jīng)箬葉多糖灌胃后可顯著增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞體外增殖能力，高劑量組的T淋巴細(xì)胞增殖能力接近正常水平。箬葉多糖聯(lián)合環(huán)磷酰胺組小鼠的淋巴細(xì)胞增殖能力明顯高于環(huán)磷酰胺組小鼠 （P＜0.05），見表2，提示箬葉多糖對(duì)環(huán)磷酰胺引起的淋巴細(xì)胞增殖能力下降有緩解作用。

2.4 對(duì)荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響 腫瘤模型組與環(huán)磷酰胺組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率與吞噬指數(shù)顯著降低；箬葉多糖高、中劑量組能顯著提高小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力，與腫瘤模型組相比具有顯著差異 （P＜0.05，P＜0.01），提高的程度與箬葉多糖的劑量呈正相關(guān)；箬葉多糖與環(huán)磷酰胺合用時(shí)能拮抗環(huán)磷酰胺對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的抑制，與環(huán)磷酰胺組比較具有顯著差異 （P＜0.05）。

表2 箬葉多糖對(duì)荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞功能及巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

3 討論

機(jī)體的免疫功能與腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)系，當(dāng)機(jī)體免疫功能低下或受抑制時(shí)，腫瘤的發(fā)生率增高。腫瘤發(fā)生后，機(jī)體可以通過免疫效應(yīng)機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用。這種免疫調(diào)節(jié)作用是目前公認(rèn)的多糖抗腫瘤的主要機(jī)制之一［10］。本實(shí)驗(yàn)研究了箬葉多糖對(duì)小鼠移植性乳腺癌的抑制作用，結(jié)果證實(shí)箬葉多糖可以改善荷瘤小鼠的一般狀態(tài)，減輕瘤質(zhì)量，抑瘤率與劑量有一定的相關(guān)性，高劑量組的抑瘤效果更好。

脾臟指數(shù)是常用的衡量藥物對(duì)脾臟的影響的指標(biāo)，可以推測(cè)藥物對(duì)機(jī)體免疫功能的影響［11］。本實(shí)驗(yàn)中，箬葉多糖中、高劑量組可顯著提高小鼠脾臟指數(shù)，且增加的程度與箬葉多糖的劑量呈正相關(guān)性。箬葉多糖與環(huán)磷酰胺聯(lián)合使用，脾臟指數(shù)較環(huán)磷酰胺組明顯增加，說明箬葉多糖能夠刺激脾臟的增長(zhǎng)，對(duì)環(huán)磷酰胺引起的免疫抑制有一定的促進(jìn)恢復(fù)的作用。

腫瘤免疫反應(yīng)主要是細(xì)胞免疫，參與細(xì)胞免疫的效應(yīng)細(xì)胞主要有細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞及巨噬細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，箬葉多糖能明顯提高荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬百分率和吞噬指數(shù)，促進(jìn)ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)，可以提高荷瘤小鼠的免疫功能。與環(huán)磷酰胺聯(lián)合使用，可以拮抗化療藥物的免疫損傷，可用于腫瘤的輔助治療［12］。由此可見，箬葉多糖具有一定的抑瘤作用，這與它能改善免疫系統(tǒng)狀態(tài)而增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤能力有關(guān)。

箬葉作為天然中草藥，資源豐富，其多糖有效成分提取工藝成熟，毒副作用小，作為抗腫瘤輔助藥物或功能食品具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。

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R285.5

B

1001-1528（2013）04-0827-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2013.04.046

2012-09-25

河北省人口和計(jì)劃生育委員會(huì)科研計(jì)劃項(xiàng)目 （2010-A06）；保定市科技局科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目 （09ZF004）

王恩軍 （1977—），男，碩士，主要從事抗腫瘤中藥藥理學(xué)研究。Tel：13833061977，E-mail：wangenjun2009@163.com