王恩軍， 劉紅霞， 黨志勇， 靳 祎， 郭曉軍， 李術(shù)娜， 李 錦

（1.河北大學，河北保定071000；2.河北農(nóng)業(yè)大學，河北保定071000；3.秦皇島市中醫(yī)院，河北 秦皇島 066000）

箬葉多糖對乳腺癌免疫抑制作用的實驗研究

王恩軍1， 劉紅霞1， 黨志勇1， 靳 祎1， 郭曉軍2， 李術(shù)娜2， 李 錦3

（1.河北大學，河北保定071000；2.河北農(nóng)業(yè)大學，河北保定071000；3.秦皇島市中醫(yī)院，河北 秦皇島 066000）

目的 觀察箬葉多糖對移植性乳腺癌荷瘤小鼠的抑制作用及免疫調(diào)節(jié)機制。方法 采用TA2小鼠的乳腺癌MA737細胞移植模型，設正常組、腫瘤模型組、陽性對照組 （環(huán)磷酰胺 25 mg/kg）、箬葉多糖高劑量組 （200 mg/kg）、箬葉多糖中劑量組 （100 mg/kg）、箬葉多糖低劑量組 （50 mg/kg）及箬葉多糖中劑量組 （100 mg/kg）聯(lián)合環(huán)磷酰胺 （25 mg/kg）組，通過瘤質(zhì)量測定箬葉多糖體內(nèi)抗乳腺癌活性，并通過淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗、巨噬細胞吞噬試驗測定荷瘤小鼠淋巴細胞、巨噬細胞功能的變化。結(jié)果 箬葉多糖中、高劑量組及箬葉多糖聯(lián)合環(huán)磷酰胺組灌胃處理后，一般情況有所改善，瘤質(zhì)量減輕，增加小鼠脾指數(shù) （P＜0.05），并促進淋巴細胞轉(zhuǎn)化，提高巨噬細胞的吞噬能力 （P＜0.05）。結(jié)論 箬葉多糖對體內(nèi)乳腺癌小鼠具有很好的抑制作用，并能增強機體免疫功能，且與環(huán)磷酰胺合用時還有增效減毒的作用。

箬葉多糖；乳腺癌；免疫；抑制作用；MA737

箬葉是禾本科植物箬竹Indocalamus tessellatus（Munro）Keng f.的葉，有特殊清香氣味，葉片寬大，常用來包粽子?！侗静菥V目》中記載其性味甘、寒，歸肺、肝經(jīng)，有清熱止血、解毒消腫、治衄血、便血、崩漏、喉痹等功效［1-3］，現(xiàn)代藥理學實驗表明箬葉具有抗炎、防腐、抗?jié)儭⒖拱滩〔《炯翱鼓[瘤等作用［4-6］。箬葉中含有多糖、茶多酚、氨基酸、維生素等成分。近些年，越來越多的研究表明多糖對人體具有極大的利用價值，本實驗采用TA2小鼠的乳腺癌MA737細胞移植模型，對箬葉多糖體內(nèi)抗乳腺癌活性及機制進行了研究，為將其開發(fā)為臨床抗癌輔助藥物提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與藥品箬葉購于江西省九江市，經(jīng)河北大學中醫(yī)學院梁先茂副教授鑒定為禾本科植物箬竹的葉；刀豆素蛋白 （ConA）及四甲基偶氮唑鹽 （MTT）購自Sigma公司，環(huán)磷酰胺購自山西普德藥業(yè) （批號20081023），RPMI-1640培養(yǎng)基及二甲基亞砜 （DMSO）購自GIBCO公司。

1.2 實驗動物與腫瘤細胞株 健康TA2小鼠，4～5周齡，20～24 g，雌性，由河北農(nóng)業(yè)大學動物科技學院提供。瘤株：MA737小鼠乳腺癌細胞株，由河北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院生物制藥系惠贈。

1.3 實驗方法

1.3.1 箬葉多糖的提取 提取方法為熱水浸提法，經(jīng)苯酚-硫酸法測定，其多糖質(zhì)量分數(shù)為49.08%。

1.3.2 建立小鼠乳腺癌模型 處死荷瘤種鼠，在無菌條件下取2～3 mm瘤組織塊 （約含3×106個MA737細胞），植于小鼠右側(cè)背部皮下，建立小鼠乳腺癌實體瘤模型。

1.3.3 實驗分組及給藥 將接種72 h后的小鼠48只隨機分為6組，每組8只。實驗設腫瘤模型組 （生理鹽水）、陽性對照組 （環(huán)磷酰胺 25 mg/kg）、箬葉多糖低劑量組（50 mg/kg）、中劑量組 （100 mg/kg）、高劑量組 （200 mg/kg）、箬葉多糖中劑量 （100 mg/kg）聯(lián)合環(huán)磷酰胺（25 mg/kg）組，另取8只未接種小鼠作為正常對照組 （蒸餾水）。蒸餾水、生理鹽水、箬葉多糖采用灌胃給藥，環(huán)磷酰胺采用皮下給藥，均為每天1次，劑量為0.1 mL/10 g，連續(xù)14 d。每日記錄各組小鼠的飲食、毛發(fā)、活動、精神狀態(tài)等體征。

1.3.4 腫瘤抑制率和脾臟指數(shù)的測定 末次給藥后24 h處死小鼠，稱定質(zhì)量。剖取各組小鼠的腫瘤組織及脾臟，并稱定質(zhì)量，計算小鼠的腫瘤抑制率和脾臟指數(shù)。

腫瘤抑制率 （%）=（1－給藥組平均瘤質(zhì)量/對照組平均瘤質(zhì)量）×100%

脾臟指數(shù) （mg/10 g）=（脾臟質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量）×10

1.3.5 淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗 采用MTT法，參考文獻［7］在無菌條件下摘取脾臟，制成脾細胞密度為5×105個/mL的懸液，并加入到培養(yǎng)板中，每孔100 μL，隨后加入終質(zhì)量濃度5 μg/mL的ConA溶液100 μL，并設相應對照孔。于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68 h，各孔加入MTT（5 mg/mL）液20 μL，再培養(yǎng)4 h，離心棄上清，各孔加入DMSO溶解，酶標儀測定A值 （波長為570 nm）。

1.3.6 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬試驗 參照文獻 ［8-9］，小鼠分組及給藥情況同上。小鼠預先在試驗前72 h腹腔內(nèi)注射淀粉肉湯培養(yǎng)基，試驗當天，在腹腔內(nèi)注射Hank's液后輕揉腹部，隨后處死小鼠，收集腹腔內(nèi)混勻的液體。取2～3滴于載玻片上，加等量的雞紅細胞懸液混勻。置于37℃水浴，用生理鹽水漂洗后干燥，瑞氏染色，觀察巨噬細胞吞噬雞紅細胞情況，計算吞噬指數(shù)及吞噬百分率。

1.4 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)以±s表示。組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察結(jié)果 正常對照組小鼠飲食正常，無明顯增減，毛發(fā)有光澤，精神狀態(tài)良好，活躍。腫瘤模型組小鼠在給藥后期出現(xiàn)飲食量減少，毛發(fā)無光澤，精神萎靡，活動量減少。箬葉多糖中、高劑量組和箬葉多糖聯(lián)合環(huán)磷酰胺組小鼠飲食、毛發(fā)、精神狀態(tài)和活動情況與正常對照組比較無明顯變化，僅有個別小鼠在給藥后期因腫瘤增大影響活動。

2.2 對荷瘤小鼠抑瘤率和脾臟指數(shù)的影響 100 mg/kg，

200 mg/kg箬葉多糖組瘤質(zhì)量均低于腫瘤模型組，抑瘤率隨劑量的增加而增強；同時與腫瘤模型組相比，100 mg/kg，200 mg/kg箬葉多糖可顯著提高小鼠脾臟指數(shù) （P＜0.05）。箬葉多糖與環(huán)磷酰胺聯(lián)合使用，與環(huán)磷酰胺組相比，瘤質(zhì)量降低，脾臟指數(shù)增加 （P＜0.05）。見表1。

表1 箬葉多糖對荷瘤小鼠體質(zhì)量、瘤質(zhì)量、抑瘤率及脾指數(shù)的影響

2.3 對荷瘤小鼠脾淋巴細胞功能的影響 腫瘤模型組小鼠T淋巴細胞增殖明顯低于正常對照組 （P＜0.01），經(jīng)箬葉多糖灌胃后可顯著增強T淋巴細胞體外增殖能力，高劑量組的T淋巴細胞增殖能力接近正常水平。箬葉多糖聯(lián)合環(huán)磷酰胺組小鼠的淋巴細胞增殖能力明顯高于環(huán)磷酰胺組小鼠 （P＜0.05），見表2，提示箬葉多糖對環(huán)磷酰胺引起的淋巴細胞增殖能力下降有緩解作用。

2.4 對荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響 腫瘤模型組與環(huán)磷酰胺組小鼠腹腔巨噬細胞吞噬率與吞噬指數(shù)顯著降低；箬葉多糖高、中劑量組能顯著提高小鼠巨噬細胞的吞噬能力，與腫瘤模型組相比具有顯著差異 （P＜0.05，P＜0.01），提高的程度與箬葉多糖的劑量呈正相關(guān)；箬葉多糖與環(huán)磷酰胺合用時能拮抗環(huán)磷酰胺對巨噬細胞吞噬功能的抑制，與環(huán)磷酰胺組比較具有顯著差異 （P＜0.05）。

表2 箬葉多糖對荷瘤小鼠脾淋巴細胞功能及巨噬細胞吞噬功能的影響

3 討論

機體的免疫功能與腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)系，當機體免疫功能低下或受抑制時，腫瘤的發(fā)生率增高。腫瘤發(fā)生后，機體可以通過免疫效應機制發(fā)揮抗腫瘤作用。這種免疫調(diào)節(jié)作用是目前公認的多糖抗腫瘤的主要機制之一［10］。本實驗研究了箬葉多糖對小鼠移植性乳腺癌的抑制作用，結(jié)果證實箬葉多糖可以改善荷瘤小鼠的一般狀態(tài)，減輕瘤質(zhì)量，抑瘤率與劑量有一定的相關(guān)性，高劑量組的抑瘤效果更好。

脾臟指數(shù)是常用的衡量藥物對脾臟的影響的指標，可以推測藥物對機體免疫功能的影響［11］。本實驗中，箬葉多糖中、高劑量組可顯著提高小鼠脾臟指數(shù)，且增加的程度與箬葉多糖的劑量呈正相關(guān)性。箬葉多糖與環(huán)磷酰胺聯(lián)合使用，脾臟指數(shù)較環(huán)磷酰胺組明顯增加，說明箬葉多糖能夠刺激脾臟的增長，對環(huán)磷酰胺引起的免疫抑制有一定的促進恢復的作用。

腫瘤免疫反應主要是細胞免疫，參與細胞免疫的效應細胞主要有細胞毒性T淋巴細胞、自然殺傷細胞及巨噬細胞。本研究結(jié)果顯示，箬葉多糖能明顯提高荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬百分率和吞噬指數(shù)，促進ConA誘導的淋巴細胞轉(zhuǎn)化反應，可以提高荷瘤小鼠的免疫功能。與環(huán)磷酰胺聯(lián)合使用，可以拮抗化療藥物的免疫損傷，可用于腫瘤的輔助治療［12］。由此可見，箬葉多糖具有一定的抑瘤作用，這與它能改善免疫系統(tǒng)狀態(tài)而增強機體抗腫瘤能力有關(guān)。

箬葉作為天然中草藥，資源豐富，其多糖有效成分提取工藝成熟，毒副作用小，作為抗腫瘤輔助藥物或功能食品具有良好的開發(fā)應用前景。

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R285.5

B

1001-1528（2013）04-0827-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2013.04.046

2012-09-25

河北省人口和計劃生育委員會科研計劃項目 （2010-A06）；保定市科技局科學技術(shù)研究與發(fā)展計劃項目 （09ZF004）

王恩軍 （1977—），男，碩士，主要從事抗腫瘤中藥藥理學研究。Tel：13833061977，E-mail：wangenjun2009@163.com