林杰，馮永濤，陳民良，劉希華，邢建宏

（三明學院資源與化工學院，福建三明365004）

無患子叢生芽誘導及植株再生研究

林杰，馮永濤，陳民良，劉希華，邢建宏

（三明學院資源與化工學院，福建三明365004）

以無患子葉片為外植體，通過正交試驗，研究無患子葉片愈傷組織誘導、愈傷組織誘導叢生芽、芽苗生根以及植株再生的最佳培養(yǎng)基組成，并對試驗數據進行極差分析和方差分析。結果表明:誘導出葉片愈傷組織的最佳培養(yǎng)基是MS+0.5 mg·L-1TDZ+0.4 mg·L-12,4-D+6.0 mg·L-1AgNO3，誘導率為86.4℅。誘導叢生芽的最佳培養(yǎng)基是MS+0.5 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1TDZ，分化率為42.5℅。誘導生根的最佳培養(yǎng)基是1/3 MS+0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-12,4-D,生根率為45℅。

無患子；愈傷組織；叢生芽；植株再生

無患子（sapindus mukorossi Gaerth.）也叫肥皂樹或洗手果，為無患子科無患子屬落葉喬木，在我國華南等地多有栽培[1]。無患子為一種多功能植物，其種皮提取物是重要的化工原料，可制成純天然洗滌產品[2]，還可作為優(yōu)良的農藥乳化劑[3]。無患子的種仁含油率高達40.7％，是生產生物柴油的理想原料[4]。此外，無患子樹形優(yōu)美，是優(yōu)良的園林綠化樹種[5]。無患子具有巨大的潛在經濟價值，市場需求量大，但低效的種苗繁育技術是制約其產業(yè)化開發(fā)的瓶頸。

無患子長期以來以種子實生繁殖為主，造成后代變異較大，篩選出的優(yōu)良個體的性狀很難保持。同時，扦插、嫁接等無性繁殖技術繁殖系數較低，很難滿足生產需求，因此，摸索無患子組培快繁技術有重要意義。關于無患子的組織培養(yǎng)研究已有一些報道。張鳳龍[6]等利用莖段作為外植體，進行了無患子組織培養(yǎng)的初步研究，獲得了完整的莖芽苗;陳光蓉[7]等利用多因子正交試驗研究了無患子愈傷組織誘導的條件，篩選出了無患子葉片愈傷組織誘導的培養(yǎng)基;周倩[8]等研究了無患子愈傷組織誘導與芽苗增殖的培養(yǎng)基配方。上述研究僅開展了摸索無患子以芽繁芽、葉片愈傷組織誘導的條件，尚未進行由葉片愈傷組織誘導分化叢生芽，進而完成植株再生的研究。本研究旨在篩選出以無患子葉片為外植體，通過誘導葉片愈傷組織，利用愈傷組織分化叢生芽，進而再生成完整植株的技術，為其快速無性繁殖以及以葉片為受體的外源基因轉化和種質保藏提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 外植體采集與消毒

以筆者所在的課題組在三明地區(qū)篩選出的無患子優(yōu)樹為材料，在連續(xù)3 d晴天后摘取幼嫩葉片若干，裝入燒杯中，加入一定量的洗衣粉和純水，攪拌浸泡30 min，之后用純水洗凈，再加入多菌靈溶液浸泡30 min，然后洗凈葉片并用流動的水沖洗3 h左右，再用75％的酒精消毒30 s，0.1％的升汞消毒9 min，最后用無菌水沖洗5次。

1.2 無患子愈傷組織誘導

以MS為基本培養(yǎng)基，附加不同質量分數的TDZ、2,4-D和AgNO3，培養(yǎng)基pH為5.8，瓊脂9.0 g·L-1，蔗糖30 g·L-1。培養(yǎng)基經121℃高壓滅菌20 min后使用。采用L9(34)正交試驗設計進行葉片愈傷組織誘導試驗，試驗設計見表1。每瓶接種1個外植體，大小為0.5 cm2。每個處理30瓶，重復3次。接種后的外植體置于光強1800 lx，光照12h·d-1，溫度（27±1）℃的環(huán)境中培養(yǎng)，4周后統計誘導率。

1.3 無患子叢生芽誘導

采用L9(34)正交試驗設計，對NAA、TDZ和KT 3個因素進行優(yōu)化，設計見表2，每瓶1個愈傷組織塊，每個處理30瓶，重復3次，8周后統計誘導率。

1.4 無患子叢生芽生根

L9(34)正交設計優(yōu)化無患子叢生芽生根的最佳培養(yǎng)基組成，其因素與水平見表3。每瓶接種1個芽苗，每個處理30瓶，重復3次。4周后統計生根情況。

表1 愈傷組織誘導的因素與水平

表2 叢生芽誘導的因素與水平

表3 誘導生根的因素與水平

2 結果與分析

2.1 無患子愈傷組織誘導

無患子葉片接種7 d之后，傷口處出現愈傷組織（如圖1-A所示），28d之后，淡綠色顆粒狀愈傷組織把整個葉片覆蓋住（如圖1-B所示）。誘導情況見表4。由表4可知，所有組合均能不同程度地誘導出愈傷組織，但不同培養(yǎng)基的誘導率和愈傷組織生長速度有差異，其中在1、2、3、6、7、8、9號培養(yǎng)基上，愈傷組織淡綠色，7、8、9號培養(yǎng)基上，愈傷組織致密狀；在4、5、6、7、8、9號培養(yǎng)基上，愈傷組織生長慢，在1、2、3號培養(yǎng)基上，愈傷組織生長快。2號培養(yǎng)基愈傷組織誘導率最高，為86.4℅，7號培養(yǎng)基愈傷組織誘導率最低，為59.3℅。

試驗結果的極差分析顯示，A因素(TDZ濃度)對愈傷組織的誘導率影響最顯著，C因素(AgNO3濃度)對愈傷組織的誘導效果影響較小，B因素(2,4-D濃度)的影響居中，3個因素的最佳組合為A1B2C2。可見，誘導無患子葉片愈傷組織的最佳培養(yǎng)基組成為：MS+0.5mg·L-1TDZ+0.4mg·L-12,4-D +6 mg·L-1AgNO3。

對正交試驗結果的方差分析見表5，結果表明TDZ濃度對愈傷組織的誘導影響明顯，而其它兩個因素的作用不顯著。

2.2無患子叢生芽誘導

將已經誘導出來的愈傷組織切成若干塊接種于含有不同濃度NAA、TDZ和KT的培養(yǎng)基上，30 d后，愈傷組織分化出芽，芽粗壯，莖節(jié)長，而且分枝形成叢生狀（如圖1-C所示），沒有分化的愈傷組織逐漸褐變，最后死亡。叢生芽誘導情況見表6。

由表6可知，8號培養(yǎng)基上叢生芽的誘導率最高，為42.5℅，4號培養(yǎng)基上叢生芽的誘導率最低，為10℅。極差分析表明，3個因素的對叢生芽的誘導效果的影響大小依次為B→A→C，最優(yōu)組合為A3B2C1。愈傷組織誘導叢生芽的方差分析列于表7。

從表7中可以看出，TDZ對叢生芽的誘導有極顯著影響，NAA對叢生芽誘導的影響達顯著水平，KT的影響不顯著。同時，試驗結果還顯示，分化率高的組合分化出芽的愈傷組織數目和平均每塊愈傷組織分化出芽的數目也多。綜上所述，MS+0.5 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1TDZ是無患子愈傷組織誘導叢生芽的理想培養(yǎng)基。

2.3 無患子叢生芽生根

將分化完全的叢生芽單個分離轉接于生根培養(yǎng)基中，3周后，芽體基部開始分化出白色的不定根（如圖1-D所示），30d之后，不定根分化達到高峰。無患子芽苗生根情況見表8。

由表8可知，9個試驗處理中生根率、生根條數、根長度和最早生根時間也各不相同，其中7號處理生根率最高，為45％，6號處理生根率最低，為27.5％。生根率高的組合其生根條數較多，相同天數根長度較長，生根時間較短。極差分析結果表明，3個因素對生根率的影響大小各不相同，6-BA濃度對生根率的影響較大，而MS濃度和2,4-D濃度對生根率影響不大。

對生根誘導正交試驗的方差分析結果（表9）顯示，6-BA對芽苗生根影響最顯著，基本培養(yǎng)基和2,4-D這兩個因素影響不顯著，上述試驗結果表明，最優(yōu)的生根培養(yǎng)基組成為A3B1C2，綜上所述，誘導叢生芽生根的最佳培養(yǎng)基是1/3 MS+0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-12,4-D。生根后的芽苗繼續(xù)培養(yǎng)2個月后獲得完整的組培苗（如圖1-E所示）。

圖1 無患子植株再生過程

3 討論

外植體的選擇對于植物的離體快繁尤為重要，無患子的快繁可采用莖段微扦插、種胚萌發(fā)和葉片誘導體胚或叢生芽等。試驗采用無患子葉片誘導叢生芽實現植株再生，能夠有效地利用原材料。在無患子組織培養(yǎng)試驗中，TDZ濃度增加不利于培養(yǎng)物的生長發(fā)育，這與劉淼等[9]得出低濃度的TDZ更適合牛皮杜鵑組培苗葉片愈傷組織的誘導和分化的結果一致。試驗發(fā)現6.0 mg·L-1AgNO3對于愈傷組織的誘導有一定的促進的作用，過高或者過低都會對其產生抑制作用。

在無患子的組織培養(yǎng)中，叢生芽誘導與增殖是一個十分關鍵的步驟，在提高芽增殖倍數的基礎上方能實現快繁。MS是木本植物組織培養(yǎng)的常用基礎培養(yǎng)基，無機鹽濃度相對偏高，就會對植株生長起到副作用。MS中大量元素含量的減少不利于無患子葉片的叢生芽誘導培養(yǎng)，這與前人在雷公藤愈傷組織誘導叢生芽中的結果相一致[10]。對愈傷組織的生長而言，只需要低濃度NAA，但對愈傷組織的誘導作用卻因物種而異。KT對無患子叢生芽的誘導無顯著影響，這與周倩等[13]在誘導無患子愈傷組織試驗中得到的結論不一致，這可能是因為所選的外植體不同引起的。

生根是無患子快繁過程中較難操作的一個環(huán)節(jié)，其中在根數上很難突破，從試驗中可以看出，大部分生根試驗僅出1～2條根。從試驗結果可知，1/3MS與0.5 mg·L-16-BA和0.5 mg·L-1的2.4-D配比最適于叢生芽生根培養(yǎng)，MS中所含的大量元素過高、6-BA和NAA濃度的增加均不利于根的分化與生長，這與同科的龍眼莖段培養(yǎng)中的結果相一致[11]。

本研究摸索出了利用無患子葉片經愈傷組織途徑進行植株再生的培養(yǎng)基配方，也為今后利用其它器官進行無患子植株再生提供了參考。但本研究僅從培養(yǎng)基配方對叢生芽分化、增殖與生根的條件進行了優(yōu)化，愈傷組織及繼代增殖效率還不夠高，離工廠化繁育尚有距離，如何優(yōu)化其它培養(yǎng)條件以獲得更高的分化、增殖與生根效率還需要進一步研究。

[1]中國科學院中國植物志編委會.中國植物志：47卷[M].北京：科學出版社,1989.

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[4]賈黎明,孫操穩(wěn).生物柴油樹種無患子研究進展[J].中國農業(yè)大學學報,2012,17(6)：191-196.

[5]徐啟定.無患子的生態(tài)功效和利用價值[J].安徽林業(yè),2010,15(3)：64-68.

[6]張鳳龍.無患子組織培養(yǎng)研究[J].山地農業(yè)生物學報,2005,24(2)：119-123.

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[8]周倩,劉飛,吳雪蓮,等.無患子組培過程中愈傷組織誘導和芽苗增殖的培養(yǎng)基配方研究[J].西南農業(yè)學報,2012, 25(4)：1382-1387.

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Study on Induction of Multiple Shoot and Plantlet Regeneration of Sapindus mukorossi Gaerth

LIN Jie,FENG Yong-tao,CHEN Min-liang,LIU Xi-hua,XING Jian-hong
(School of Resources and Chemical Engineering,Sanming University,Sanming 365004,Chian)

The best mediums of the callus induction,multiple shoot induction,rooting and plant regeneration were studied by orthogonal design with using the leaves of Sapindus mukorossi Gaerth.as materials in this paper,and the experimental data were analyzed by range analysis and variance analysis.The results showed that the best culture medium for inducing callus from the leaves of Sapindus mukorossi Gaerth.is MS supplemented with 0.5 mg·L-1TDZ+0.4 mg·L-12,4-D+6 mg·L-1AgNO3,with an induction rate of 86.4％.The best culture medium for inducing multiple shoot is MS supplemented with 0.5 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1TDZ,and induction rate of 42.5％.The best culture medium for inducing rooting is 1/3 MS+0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-12,4-D,and induction rate is 45％.

Sapindus mukorossi Gaerth；orthogonal design callus；multiple shoot；plantlet regeneration

Q943.1

A

1673-4343（2013）04-0083-05

2013-06-21

國家大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201211311012）；福建省質量工程建設項目（ZL1001/JT(sj)）

林杰，男，江蘇徐州人，大學生；通訊作者:邢建宏，男，陜西寶雞人，講師。研究方向:林業(yè)與生物技術研究。