何翠瑤，谷容，王剛，王法祥

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院臨床藥學(xué)室，重慶 400014;2.南昌大學(xué)附屬第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，南昌 330008)

顳葉癲癇(temporal lobe epilepsy，TLE)是一種以反復(fù)抽搐發(fā)作為特點(diǎn)的常見(jiàn)神經(jīng)系統(tǒng)疾病。因?yàn)楹Ｈ怂?(kainic acid，KA)致癲癇模型在病程、病理、電生理等方面與人類顳葉癲癇非常相似而被廣泛用于研究人類顳葉癲癇［1］。STE20(mammalian sterile 20，STE20)是釀酒酵母的一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，位于MAPK級(jí)聯(lián)通路的上游，而MST3是哺乳動(dòng)物STE20絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員。新近研究顯示，Ste20蛋白激酵素MST3在促進(jìn)細(xì)胞凋亡中起到了重要作用［2，3］。而癲癇的發(fā)病機(jī)制以神經(jīng)元損傷為主，凋亡是癲癇所致神經(jīng)元死亡的重要機(jī)制。由此，提示MST3可能在癲癇發(fā)病過(guò)程中起到重要的作用，而目前對(duì)MST3在癲癇中的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究采用海人酸所致癲癇模型，從基因、蛋白和組織形態(tài)學(xué)角度觀察MST3在海馬內(nèi)的分布特點(diǎn)和動(dòng)態(tài)表達(dá)特點(diǎn)，為進(jìn)一步探討MST3與神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的關(guān)系以及在調(diào)控癲癇發(fā)生發(fā)展中的作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

海人酸(kainic acid，KA;SIGMA公司)，兔抗小鼠 MST3 抗體(mammalian sterile 20－like kinase 3，MST3;Abcam公司)，生物素化山羊抗兔二抗(博士德公司)，RNA 提取試劑盒，Quant一步法 RT－PCR試劑盒(天根公司)，腦立體定向注射儀(Narishige公司)，Olympus光學(xué)顯微鏡，Zeiss熒光顯微鏡(Oberkochen，Germany)，LEICA QWin 圖像處理與分析系統(tǒng)(德國(guó))。

1.2 動(dòng)物分組、模型制備、取材處理措施

取SPF級(jí)雄性 C57BL/6小鼠，體重20 ～22 g，8～10周齡，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［SCXK(渝)2007－0001］;飼養(yǎng)在重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［SYXK(渝)2007－0001］，每日光照 12 h，黑暗12 h，水食任意攝取，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組，模型組小鼠又根據(jù)時(shí)相點(diǎn)不同分為 KA注射后3、8、24 h組，每組6只。模型組和對(duì)照組小鼠均經(jīng)4%水合氯醛腹腔麻醉后固定于腦立體定位儀上，去頭頂部毛與消毒皮膚后正中切口，暴露前囟。根據(jù) Franklin，KBJ小鼠腦立體定向圖譜確定右側(cè)腦室注射點(diǎn)坐標(biāo):于前囟后0.4 mm，中線右側(cè)1.0 mm處，用電鉆小心鉆透顱骨，微量注射器自腦表面垂直進(jìn)針2.3 mm，向右側(cè)側(cè)腦室緩慢注入2 μL(200 ng)，注射時(shí)間10 min，留針5 min，緩慢退針。所有操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行，皮膚切開(kāi)處用青霉素抗菌，縫合傷口。生理鹽水(NS)組注射等量NS。

模型組與對(duì)照組分別于處理后3、8、24 h直接或灌注后取腦，用于做RT－PCR、Western blot以及做免疫組織化學(xué)分析。

1.3 RT-PCR檢測(cè)MST3 mRNA的表達(dá)

采用RT－PCR方法檢測(cè)，按照說(shuō)明書Trizol法提取總RNA。采用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。取總 RNA 2 μg，于 PCR 儀 42℃ 30 min(cDNA 合成)，99℃ 5 min(逆轉(zhuǎn)錄酶失活)，5℃ 5 min，－20℃保存?zhèn)溆?。PCR擴(kuò)增引物:由上海生工技術(shù)有限公司合 成。Mouse MST3，上 游 引 物:5＇－AGCCGAGGACGAGATAGAG－3＇，下 游 5＇－TCGTAGGCTGACTGCTTGA－3＇，退火溫度為 58℃，擴(kuò)增片段為 414 bp;mouse GAPDH退火溫度為 56℃，上游引物 5＇－TGTCGTGGAGTCTACTGGTG－3＇，下 游 引 物 5＇－CTTCTGGGTGGCAGTGAT－3＇，擴(kuò)增片段為 277 bp。應(yīng)用BIO－PROFIF凝膠圖象分析系統(tǒng)對(duì)目的電泳條帶進(jìn)行分析，以相應(yīng)的內(nèi)參電泳條帶作為參照，結(jié)果以兩者之積分吸光度的比值表示。

1.4 Western blot檢測(cè)MST3蛋白的表達(dá)

將各組處理后的蛋白樣品經(jīng)10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳80 min，再以100 mA電流持續(xù)轉(zhuǎn)膜40 min，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h后加入一抗 (1.1000)，4℃孵育過(guò)夜。過(guò)夜后復(fù)溫至室溫，TBST緩沖液反復(fù)洗膜5 min ×3次，加入二抗 (1.1000)，37℃孵育1 h，再以TBST緩沖液反復(fù)洗膜5 min×6次。加入等比例化學(xué)發(fā)光試劑A與B后，直接在成像儀進(jìn)行顯影與采圖。

1.5 免疫組織化學(xué)染色

將切片脫蠟至水，0.01 mol/L枸櫞酸鹽液微波熱修復(fù)抗原，3℃ H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化酶 10 min，BSA 37℃ 溫箱封閉 20 min，滴加 MST一抗(1.100)4℃冰箱過(guò)夜，滴加羊抗兔二抗37℃溫箱1 h，SABC 37℃ 20 min，DAB 顯色鏡下控制 3 min，脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物行為學(xué)觀察

正常對(duì)照組小鼠無(wú)抽搐等異常表現(xiàn)。KA注射后小鼠呈現(xiàn)以下表現(xiàn):(1)急性期:KA注射后幾分鐘，小鼠出現(xiàn)點(diǎn)頭、咀嚼及上肢抖動(dòng)等癥狀，繼而表現(xiàn)為翻滾、轉(zhuǎn)圈，肢體尾部強(qiáng)直等癲癇持續(xù)狀態(tài)，持續(xù)3～5 h。(2)靜止期:癥狀基本消失，可有易激惹和較強(qiáng)的攻擊行為。

2.2 注射KA后MST3 mRNA表達(dá)變化

與正常對(duì)照組相比，側(cè)腦室注射KA后，海馬組織的MST3 mRNA在3、8、24 h的表達(dá)均有升高，且呈現(xiàn)時(shí)間遞增關(guān)系，24 h達(dá)到最高峰，差異有顯著性(見(jiàn)表 1;圖 1，2)。

表1 正常對(duì)照和癲癇實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚆ST3的mRNA和蛋白表達(dá)(，n=6)Tab.1 Expression of MST3 mRNA and protein in the PBS control and experimental groups of mice(，n=6)

表1 正常對(duì)照和癲癇實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚆ST3的mRNA和蛋白表達(dá)(，n=6)Tab.1 Expression of MST3 mRNA and protein in the PBS control and experimental groups of mice(，n=6)

注:*P ＜0.05 vs.PBS對(duì)照組;＊＊P ＜0.05 vs.PBS對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組3、8 h。Note:*P ＜0.05 vs.PBS control group;＊＊P ＜0.05 vs.PBS control group，and experimental group 3，8 h.

組別Groups蛋白表達(dá)Protein expression PBS對(duì)照組 PBS control group 0.169716±0.0119 73.2744±6基因表達(dá)mRNA expression.68926模型組3 h Experimental group 3 h 0.469716±0.0216* 132.5437±16.36904*模型組8 h Experimental group 8h 0.684593±0.0205 165.2685±17.96852模型組 24 h Experimental group 24 h 0.894884±0.0470＊＊ 175.6275±17.40065＊＊

注:M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn);1:PBS對(duì)照組;2:模型組 3 h;3:模型組 8 h;4:模型組 24 h。圖1 正常對(duì)照和癲癇實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚆ST3的mRNA表達(dá)Note:M:Marker;1:PBS control group;2:Experimental group 3 h;3:Experimental group 8 h;4:Experimental group 24 h.Fig.1 Expression of MST3 mRNA in the mice of PBS control and experimental groups

圖2 正常對(duì)照和癲癇實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚆ST3的mRNA表達(dá)Fig.2 Expression of MST3 mRNA in the mice of PBS control and experimental groups

2.3 注射KA后MST3蛋白表達(dá)變化

與正常對(duì)照組相比，側(cè)腦室注射KA后，海馬組織的MST3蛋白表達(dá)在3、8、24 h的表達(dá)均有升高，且呈現(xiàn)時(shí)間遞增關(guān)系，24 h達(dá)到最高峰，具有顯著性意義(見(jiàn)表 1;圖 3，4)。

2.4 MST3在海馬的組織表達(dá)特點(diǎn)

MST3在正常對(duì)照組小鼠海馬各區(qū)的表達(dá)不明顯，但MST3在癲癇模型中主要表達(dá)分布于海馬神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)，各區(qū)反應(yīng)強(qiáng)度不等，以齒狀回和 CA3區(qū)最明顯，其次為門區(qū)，CA1區(qū)也有少量表達(dá)。這些MST陽(yáng)性細(xì)胞胞體中等大小，形態(tài)不規(guī)則，自胞體向四周發(fā)出多個(gè)短而粗大的突起，胞質(zhì)著色均勻，突起也著色，胞核未著色(見(jiàn)圖5，封底)。

注：A. PBS正常對(duì)照齒狀回；B. PBS正常對(duì)照門區(qū)；C. 模型齒狀回；D. 模型門區(qū)；E. PBS正常對(duì)照CA3區(qū)；F. 模型CA3區(qū)；G. PBS 正常對(duì)照CA1區(qū)；H. 模型CA1區(qū)。圖5 正常對(duì)照和癲癇實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚆ST3的免疫組織化學(xué)染色Note: A. Dentate gyrus, PBS control group; B. Hilus, PBS control group; C. Dentate gyrus, experimental group; D. Hilus, experimental group; E. CA3 area, PBS control group; F. CA3 area, experimental group; G. CA1 area, PBS control group; H.CA1 area, experimental group.Fig.5 Expression of MST3 protein in the mice of PBS control and experimental groups. Immunohistochemical staining

3 討論

本實(shí)驗(yàn)研究了KA致顳葉癲癇模型中MST3在海馬海馬神經(jīng)元中的表達(dá)特點(diǎn)、海馬CA1、CA3等不同區(qū)域的表達(dá)特點(diǎn)，以及在癲癇模型中不同時(shí)間段的動(dòng)態(tài)表達(dá)規(guī)律。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MST3在正常對(duì)照組小鼠海馬各區(qū)的表達(dá)不明顯，但MST3在癲癇模型中主要表達(dá)分布于海馬神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)。說(shuō)明MST3與神經(jīng)元之間有一定的關(guān)系。MST3在癲癇模型中海馬各區(qū)表達(dá)量也有不同，以齒狀回和CA3區(qū)最為明顯，提示MST3與該區(qū)域的神經(jīng)元之間互動(dòng)作用可能更加明顯。同時(shí)我們也觀察到，MST3在3 h，8 h，24 h基因、蛋白水平表達(dá)呈現(xiàn)明顯的增加趨勢(shì)。說(shuō)明隨著癲癇發(fā)作過(guò)程中，在腦損傷程度增加情況下，MST的表達(dá)也隨之增加。但是在這個(gè)過(guò)程中，到底是起到什么作用仍然需要進(jìn)一步論證和研究。

癲癇是由大腦神經(jīng)元反復(fù)過(guò)度放電引起的發(fā)作性、突然性、短暫性的大腦功能障礙，在癲癇發(fā)作過(guò)程中，正是這種損害發(fā)作誘導(dǎo)了神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，造成了神經(jīng)細(xì)胞的死亡［4，5］。1994 年，Pollard等［6］首次報(bào)道了大鼠一側(cè)杏仁核注射海人酸(kainic acid，KA)致癇后4～48 h神經(jīng)元凋亡的變化。他們發(fā)現(xiàn)，癲癇發(fā)作后24 h，海馬 CA3和 CA4區(qū)出現(xiàn)大量凋亡神經(jīng)元，其中CA3區(qū)錐體層在24 h和48 h各有30%和60%的細(xì)胞呈現(xiàn)TUNEL陽(yáng)性染色，而CA1區(qū)僅有少量陽(yáng)性染色。另有研究提示，在癲癇過(guò)程中，與凋亡相關(guān)的各種基因在此過(guò)程也有明顯的變化，如立早基因(immediate early genes，IEGS)、p53 基因及 bcl－2 基因家族等［5，7］。另有一些報(bào)道證實(shí)了MST家族在細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡中起重要的作用。

Mammalian sterile 20－like kinase 3(MST3)是哺乳動(dòng)物STE20絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員之一，分子量50×103。STE20家族包括 PAK和 GCK兩個(gè)亞族，MST1和 MST2屬于 GCK II，MST3和MST4屬于 GCK III［8］。先前已有研究結(jié)果證實(shí)了MST1和 MST2在細(xì)胞生長(zhǎng)方面起到重要的作用［8，9］。在后繼的研究中發(fā)現(xiàn)，MST1 在神經(jīng)細(xì)胞凋亡中起了重要的作用［10］。包括新近一項(xiàng)研究闡明了c－Abl－MST1信號(hào)通路可能參與了神經(jīng)退行性疾病的病理過(guò)程，說(shuō)明有關(guān) c－Abl－MST1信號(hào)通路介導(dǎo)的氧化壓力在神經(jīng)細(xì)胞凋亡中起到較為重要的作用［11］。MST3與MST1在促進(jìn)細(xì)胞凋亡有著類似之處，可能主要通過(guò)被caspase酶切激活后促進(jìn)細(xì)胞凋亡［12，13］，相關(guān)研究也主要證明了 MST3在氧化壓力及缺氧條件誘導(dǎo)的人滋養(yǎng)體細(xì)胞凋亡過(guò)程中的作用［14，15］。而我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著腦損傷程度的增加，MST3的表達(dá)量也呈現(xiàn)線性增加。這個(gè)結(jié)果提示，MST3在癲癇發(fā)病過(guò)程中，在介導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡過(guò)程中，可能發(fā)揮積極的作用。

MST3與癲癇發(fā)作神經(jīng)細(xì)胞凋亡關(guān)系密切相關(guān)，甚至在神經(jīng)元的分化、成熟、維持可能有一定作用關(guān)系，因此MTS的表達(dá)在癲癇形成及癲癇所致的腦組織損傷有重要意義，而MST通過(guò)怎樣的信號(hào)傳導(dǎo)途徑介導(dǎo)癲癇的發(fā)作，尤其是MST3在神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的具體作用以及分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步的研究和深入。

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