劉一，隋麗華，曾林，宋宏立，武際榮，陳旖，趙彥斌，劉冰，孫兆增*，王新

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 青島 266109;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，北京 100071;3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海都學(xué)院，山東萊陽(yáng) 265200;4.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)校醫(yī)院，山東 青島 266109)

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF－β1)幾乎作用于所有細(xì)胞，其生物學(xué)活性十分廣泛，對(duì)于細(xì)胞有促進(jìn)其增殖和增強(qiáng)活性的作用，亦有趨化作用［1］。TGF－β1作為一種轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子具有免疫抑制、促進(jìn)間質(zhì)來(lái)源細(xì)胞的增殖和功能并能誘導(dǎo)許多包括單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞趨化，這表明其在多種炎性反應(yīng)中起到重要作用［2－4］。小腸結(jié)腸炎是一種常見(jiàn)的腸道疾病。目前腸炎性結(jié)腸炎模型的建立方法繁多，模型建立成功的鑒定方法標(biāo)準(zhǔn)多但存在檢測(cè)不敏感、檢出率底、檢出周期長(zhǎng)等特點(diǎn)。建立一種新型快捷的檢測(cè)方法將會(huì)為動(dòng)物模型的建立創(chuàng)造方便。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)灌胃的方式建立腸炎性小鼠模型，運(yùn)用熒光定量PCR方法觀察TGF－β1在腸炎性反應(yīng)中的表達(dá)特點(diǎn)，以期更進(jìn)一步了解 TGF－β1與組織器官發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，為熒光定量在腸炎性小鼠動(dòng)物模型檢測(cè)提供一些參考。

1 材料和方法

1.1 材料

大腸桿菌O127由本室保存，SPF級(jí)BALB/c小鼠36只，體重19～21 g，雌雄各半，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［SCXK(軍)2007－004］，Trizol(Invitrogen，Life Technologies Corporation，美國(guó))，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，大連寶生物)，SYBR Premix Ex TaqⅡ(Takara，大連寶生物)，引物由 Invitrogen公司合成，實(shí)驗(yàn)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行［SYXK(軍)2007－004］。

1.2 方法

1.2.1 菌落計(jì)數(shù)

復(fù)蘇保存菌種 O127，挑取單菌落，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。利用培養(yǎng)細(xì)菌并10倍遞增稀釋?zhuān)?.0×106，1.0×107倍稀釋液涂布 LB固體瓊脂平板各兩塊，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，記錄菌落數(shù)。求出同稀釋度的各平板平均菌落數(shù)，計(jì)算原始菌液中的菌體濃度。

1.2.2 建立動(dòng)物模型

36只小鼠隨機(jī)分成6組，分別經(jīng)灌胃給予不同劑量的大腸桿菌，灌胃前禁食24h。1組劑量5×107個(gè)，2組劑量 2.5×108個(gè)，3組劑量 5×108個(gè)，4組劑量2.5×109個(gè)，5組劑量5×109個(gè)，對(duì)照組給予相同劑量的生理鹽水。每隔6h觀察小鼠形態(tài)并記錄，72 h后采集結(jié)腸組織并保存處理。

1.2.3 總RNA的提取及cDNA的合成

取采集的結(jié)腸組織50～100mg，用液氮研磨至粉末狀，立即放入1 mL Trizol(Invitrogen公司，TRIzol Reagent試劑)，按照試劑說(shuō)明書(shū)操作。用ND2100微量核酸蛋白定量測(cè)定儀測(cè)定RNA濃度和A260/280值，判斷其質(zhì)量。cDNA的合成按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作(Takara公司PrimeScriptTMRT Reagent Kit試劑盒)。5 × PrimeScript buffer 4 μL，Prime Script RT Enzyme MixⅠ 1 μL，Oligo dT Primer 1 μL，Random 6 mers 1 μL，Total RNA(1000ng/濃度)，RNase Free dH2O 13－VRNA，總體積 20 μL。反應(yīng)條件，37℃30 min，85℃ 7 s。獲得 cDNA 分裝后于 －20℃保存。

1.2.4 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank上公布的鼠TGF－β1序列設(shè)計(jì)引物，其上游引物序列為:5’－ggataccaactattgcttcagtcc－3’，下游引物序列為:5’－aggctccaaatataggggcagg gtc－3’。內(nèi)參 gapdh 引物上游序列為:5’－actccactcacggcaaattcg－3’，下游序列為:5’－ggcctcaccccatttgatg－3’。引物均由Invitrogen公司合成。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR條件優(yōu)化

根據(jù)Takara公司提供試劑盒反應(yīng)條件設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。樣本 cDNA 2 μL，TGF－β1 上下游引物各 1(0.3～1)μL gapdh上下游引物各 1(0.3～1)μL，2×Taq PCR 10 μL，加水補(bǔ)充至 20 μL 體積。反應(yīng)條件:擴(kuò)增曲線圖繪制，預(yù)變性 95℃1 min;變性 94℃ 40 s，退火(50～62)℃ 40 s循環(huán)40次;溶解曲線圖繪制，95℃1 min;58℃1 min;58℃循環(huán)123次(每隔0.3℃采集一次熒光信號(hào))，至94.6℃。在該過(guò)程中確定最佳反應(yīng)體系，最佳反應(yīng)退火溫度。

1.2.6 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

將標(biāo)準(zhǔn)品按濃度梯度5倍倍比稀釋?zhuān)蒙鲜龇磻?yīng)體系與條件，進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，獲得兩種基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.7 樣品檢測(cè)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用優(yōu)化條件對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。設(shè)無(wú)DNA模板的陰性對(duì)照。利用所得Ct值跟標(biāo)準(zhǔn)曲線圖計(jì)算拷貝數(shù)。運(yùn)用SAS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。組間差異應(yīng)用單因素方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腸炎性小鼠模型的建立

觀察發(fā)現(xiàn)各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，精神萎靡，被毛蓬亂，實(shí)驗(yàn)組小鼠均不同程度的出現(xiàn)稀便、軟便。解剖發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組2組、3組、5組部分小鼠結(jié)腸部有出血斑。依據(jù)常規(guī)腸炎性小鼠模型建立標(biāo)準(zhǔn)的大體形態(tài)學(xué)和損傷標(biāo)準(zhǔn)判定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型成立。

2.2 總RNA提取結(jié)果

提取的樣品總RNA用ND2100微量核酸蛋白定量測(cè)定儀測(cè)定RNA濃度和A260/280值。各組樣品的A260/280值在1.8～2.0之間，純度較好，可使用。取稀釋過(guò)的RNA樣品6 μL，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(如圖1)，28S、18S兩條條帶清晰完整，說(shuō)明提取的總RNA質(zhì)量可靠無(wú)降解。

注:M:DL2000分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1～8:不同組隨機(jī)抽取RNA樣本。圖1 小鼠結(jié)腸組織提取RNA電泳結(jié)果圖Note:M:DL2000 DNA marker;1 －8:RNA extracted from the colon tissue of the miceFig.1 The results of electrophoresis of the total RNA extracted from the colon tissue of the mice

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR條件優(yōu)化結(jié)果

引物用量為 0.4 μL，總體系20 μL;退火溫度為gapdh 58℃，TGF－β158℃。

2.4 熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.0 E+9，2.0E+8，4.0E+7，8.0E+6，1.6E+6五個(gè)濃度梯度倍比稀釋。由軟件給出所繪圖可以得出:所作 TGF－β 標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為 －3.352，r2為0.996，擴(kuò)增效率為 98.8%;內(nèi)參 gapdh斜率為－3335。r2為0.995，擴(kuò)增效率為99.5%。由此可見(jiàn)兩個(gè)基因的擴(kuò)增效率良好，此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可信(如圖2)。

2.5 試驗(yàn)樣品統(tǒng)計(jì)

通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組 TGF－β1的表達(dá)水平明顯升高。實(shí)驗(yàn)組之間無(wú)明顯差異，與對(duì)照組有明顯差異。其中P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

注:A.TGF－β1標(biāo)準(zhǔn)曲線圖;B.gapdh標(biāo)準(zhǔn)曲線圖;C.TGF－β1溶解曲線;D.gapdh溶解曲線。圖 2 TGF－β1、內(nèi)參 gapdh 標(biāo)準(zhǔn)曲線Note:A.The linearity of the standard curves for TGF－β1，B.The linearity of the standard curves for gapdh;C.The solubility curve of TGF－β1;D.The solubility curve of gapdh.Fig.2 The standard curves of TGF－β1 and gapdh

腸炎性動(dòng)物模型的建立方法主要有免疫學(xué)方法，化學(xué)刺激法，物理刺激法及復(fù)合法［5］。模型建立的檢測(cè)方法亦有多種，主要有免疫組化、血清學(xué)、分子生物學(xué)等。這些檢測(cè)技術(shù)存在檢測(cè)不敏感、檢出率低、發(fā)病率低、檢出周期長(zhǎng)等不足。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)菌液灌胃的方法亦成功建立腸炎性動(dòng)物模型，并利用熒光定量PCR法鑒定機(jī)體TGF－β1因子的變化檢測(cè)模型的建立情況，從而確定動(dòng)物模型建立。

熒光定量PCR是指通過(guò)熒光染料或特異性熒光探針，對(duì)PCR反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)，并結(jié)合相應(yīng)的軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品初始模板量的定量分析方法［6］。與常規(guī)PCR方法相比，實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增和檢測(cè)過(guò)程一步完成，簡(jiǎn)化了試驗(yàn)操作步驟，減小了試驗(yàn)誤差，且靈敏性高。近年來(lái)熒光定量PCR技術(shù)漸近成熟，其在一些難以檢測(cè)的疾病及病毒病、細(xì)菌病及寄生蟲(chóng)病的檢測(cè)中應(yīng)用廣泛［7－9］。其轉(zhuǎn)基因動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜋z測(cè)中應(yīng)用較多［10，11］。我們利用其誤差小，檢測(cè)靈敏，檢測(cè)機(jī)體細(xì)胞因子的表達(dá)量差異，從而準(zhǔn)確、快速的確定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立成功與否。

TGF－β1作為一種有效的免疫抑制劑能夠抑制各類(lèi)淋巴細(xì)胞增殖和發(fā)揮作用，并具有促進(jìn)間質(zhì)來(lái)源細(xì)胞的增值和功能。其在炎性反應(yīng)中具有顯著變化。對(duì)于小鼠腸炎性動(dòng)物模型建立過(guò)程中，由于炎性反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致TGF－β1在結(jié)腸組織中的表達(dá)量發(fā)生變化，通過(guò)檢測(cè)其相對(duì)表達(dá)量可以快速、簡(jiǎn)便的確定動(dòng)物模型的建立。

實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立腸炎性動(dòng)物模型模擬腸炎并通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)機(jī)體中TGF－β1的表達(dá)量。通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出菌液灌胃方法建立動(dòng)物模型耗時(shí)相對(duì)較短，檢測(cè)較為迅速，且與解剖結(jié)果基本相符。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn) TGF－β1在各實(shí)驗(yàn)組都有升高，而各實(shí)驗(yàn)組比較會(huì)發(fā)現(xiàn)不同劑量的實(shí)驗(yàn)組隨著濃度的增加先降低再升高，是否有一定的規(guī)律性還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果明顯，為以后通過(guò)利用實(shí)時(shí)熒光PCR來(lái)檢測(cè)機(jī)體某些因子表達(dá)量來(lái)檢測(cè)動(dòng)物模型建立提供了有力依據(jù)。

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