馬紅獻(xiàn)，劉勤英，史建偉，張利眾，李 中

(1淶源縣醫(yī)院，河北保定074300;2河北大學(xué)附屬醫(yī)院;3保定市第一醫(yī)院)

結(jié)直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，近年來發(fā)病率呈上升趨勢，5年生存率為50%～60%［1］。患者生存預(yù)后不佳的重要原因是腫瘤的局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。細(xì)絲蛋白A(FLNa)是細(xì)絲蛋白家族的重要成員，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和遷移，與細(xì)胞骨架形成、細(xì)胞形狀動態(tài)改變以及抵抗細(xì)胞外破壞性機(jī)械壓力有關(guān)［2］。近期我們采用免疫組化法檢測了結(jié)直腸腺癌組織及正常黏膜組織中FLNa蛋白的表達(dá)情況，并分析FLNa蛋白表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性，探討其在結(jié)直腸癌患者預(yù)后中的價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 46例標(biāo)本均隨機(jī)選取自河北大學(xué)附屬醫(yī)院2005年1月～2006年12月的結(jié)直腸癌手術(shù)患者的蠟塊標(biāo)本。其中男27例，女19例;年齡34～80歲，平均58歲。癌組織取自癌灶中心處，正常黏膜組織取自距癌灶邊緣至少10cm處。全部入組病例均經(jīng)病理檢查確診，且其他器官無原發(fā)腫瘤，無放、化療及免疫治療史，均有完整的臨床及隨訪資料。隨訪截止日期為2011年7月。

1.2 FLNa蛋白表達(dá)檢測方法 應(yīng)用免疫組化SP法檢測結(jié)直腸腺癌組織及正常黏膜組織中FLNa蛋白的表達(dá)情況，試劑盒購于中杉金橋公司，單克隆兔抗人FLNa一抗購自Epitomics公司。DAB顯色劑購自Tiangen公司。嚴(yán)格按免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行操作，PBS溶液取代一抗著色作為陰性對照，正常人子宮組織染色作為陽性對照。

1.3 免疫組化結(jié)果判斷 FLNa蛋白分布于細(xì)胞胞質(zhì)。于高倍鏡下選取5個視野，每個視野觀察約200個細(xì)胞，統(tǒng)計細(xì)胞陽性率:著色顆粒分為不明顯、稀疏、一定量和彌漫性等4種級別;著色程度分淡染、淡黃、棕黃和棕褐。對每張切片的陽性率及染色強(qiáng)度進(jìn)行綜合分析:陽性細(xì)胞＜25%，染色較淡，無明顯著色顆粒者判定為“-”;陽性細(xì)胞在25%～＜50%，染色淡，著色顆粒稀疏者為“+”;陽性細(xì)胞在50%～75%，染色棕黃，具有一定量著色顆粒者定為“++”;陽性細(xì)胞數(shù)≥75%，染色棕褐，著色顆粒彌漫者定為“+++”。由2名高資質(zhì)臨床病理醫(yī)師共同閱片，確定最終判定結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。FLNa在正常組織和癌組織表達(dá)情況比較采用χ2檢驗(yàn)，多因素分析采用Cox回歸模型，F(xiàn)LNa表達(dá)陰性與陽性者生存分析采用Kaplan-Meier法，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

FLNa蛋白在結(jié)直腸腺癌組織中表達(dá)-為24例，+為12例，++為10例，陽性率為47.8%，正常組織中﹣為4例，+為5例，++為13例，+++為24例，陽性率為92.3%，兩組FLNa蛋白表達(dá)陽性率比較，P=0.000(χ2=41.559)，見圖1。將患者年齡、性別、腫瘤發(fā)生部位(結(jié)腸與直腸)、腫瘤侵潤深度(侵及漿膜與未侵及漿膜)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況(有、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)及FLNa表達(dá)(陽性與陰性)等因素引入Cox回歸模型進(jìn)行多因素分析，結(jié)果顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤浸潤深度及FLNa表達(dá)是影響結(jié)直腸腺癌術(shù)后患者預(yù)后的獨(dú)立因素(表1)。FLNa表達(dá)陽性與陰性者的中位生存時間分別為63、26個月，F(xiàn)LNa蛋白陰性表達(dá)者的死亡風(fēng)險是陽性表達(dá)者的3.856倍，其95%的可信區(qū)間為7.326～19.421。兩組生存率的Log-rank檢驗(yàn)提示差異有有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)，生存曲線見圖2。

圖1 結(jié)直腸腺癌組織及正常組織中FLNa蛋白的表達(dá)(SP×200)

表1 46例患者的多因素分析

圖2 FLNa表達(dá)情況與生存期分析

3 討論

FLNa蛋白主要分布于細(xì)胞胞質(zhì)，其基因結(jié)構(gòu)保守，廣泛表達(dá)于哺乳動物的組織器官中，對組織器官形成發(fā)育具有重要功能。FLNa蛋白二聚體亞基的長度約80 nm、相對分子質(zhì)量約280 kD，兩條相同的多肽鏈于羧基端相連接，形成的“V”型同源二聚體具有生物學(xué)功能。FLNa蛋白的棒狀結(jié)構(gòu)域中含有多重β-片層結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)為多種具有重要功能的蛋白質(zhì)間的相互作用提供了平臺，并且其中的多數(shù)蛋白質(zhì)是細(xì)胞信號分子的膜受體，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、遷徙、黏附等多種生物學(xué)行為［2］。

目前有關(guān)FLNa與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)性的研究較少。史建偉等［3～5］通過研究FLNa蛋白在60例結(jié)直腸癌患者的癌組織及其正常結(jié)直腸黏膜組織的表達(dá)情況，并結(jié)合臨床資料進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)FLNa蛋白在結(jié)直腸腺癌組織中的陽性表達(dá)率為50.0%，而在正常結(jié)直腸黏膜組織的陽性率為91.7%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。FLNa的低表達(dá)與結(jié)直腸腺癌的肝轉(zhuǎn)移、腸壁的浸潤深度、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移相關(guān);經(jīng)脂質(zhì)體成功將FLNa cDNA轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞，過表達(dá)FLNa基因后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LNa能夠抑制SW480細(xì)胞的體內(nèi)、體外侵襲能力，其作用機(jī)制與MMP-9的表達(dá)水平降低有關(guān)。本研究亦發(fā)現(xiàn)，癌組織中的FLNa蛋白表達(dá)明顯低于正常黏膜組織，進(jìn)一步的多因素分析發(fā)現(xiàn)FLNa是結(jié)直腸腺癌患者術(shù)后生存的獨(dú)立影響因素，生存分析表明FLNa蛋白低表達(dá)患者的生存時間明顯短于FLNa蛋白高表達(dá)患者。

有關(guān)FLNa抑癌的機(jī)制目前尚不完全清楚。Fiori等［6］研究發(fā)現(xiàn)，與表達(dá)FLNa的 M2A7細(xì)胞相比，受表皮生長因子(EGF)刺激后，缺失FLNa的M2細(xì)胞中表皮生長因子受體酪氨酸的泛素化水平較低。進(jìn)一步深入研究證實(shí)，F(xiàn)LNa蛋白的缺乏可影響泛素連接酶c-Cb1鏈與表皮生長因子受體相互作用，細(xì)胞中抗表皮生長因子誘導(dǎo)的表皮生長因子受體降解受到明顯的抑制，但在表達(dá)FLNa的細(xì)胞中表皮生長因子受體的降解卻非常活躍，因此推測FLNa可能通過下調(diào)表皮生長因子受體的活性，對腫瘤細(xì)胞的增殖具有抑制作用。Zhu等［7］研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LNa通過Ras-GRF1參與調(diào)節(jié)Ras/ERK信號通路，下調(diào)細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶-9的含量，抑制其對細(xì)胞外基質(zhì)的降解能力，最終阻遏腫瘤細(xì)胞的黏附和遷移。研究［8］還發(fā)現(xiàn)FLNa能夠與Smads蛋白家族成員相互結(jié)合，共同調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)信號，阻遏腫瘤細(xì)胞的遷移，相反，在不表達(dá)FLNa的腫瘤細(xì)胞中則不存在TGF-β信號。另外，酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的多項(xiàng)研究還證實(shí)，F(xiàn)LNa特異性地與G蛋白耦聯(lián)受體(鈣受體和多巴胺受體)、小 GTP結(jié)合蛋白(CDC42，Rac和Rho)以及其下游效應(yīng)分子(SEK1)結(jié)合，共同調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，F(xiàn)LNa與結(jié)直腸腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，且可作為預(yù)后判斷的重要指標(biāo)，但FLNa如何發(fā)揮其抑癌生物學(xué)效應(yīng)還有待進(jìn)一步深入研究。

［1］Jemal A，Siegel R，Ward E，et al.Cancer statistics，2008［J］.CA Cancer J Clin，2008，58(2):71-96.

［2］Nakamura F，Osbiorn TM，Hartemink CA，et al.Structure basis of filamin A functions［J］.J Cell Biol，2007，179(5):1011-1025.

［3］史建偉，王貴英，張鴻濱，等.細(xì)絲蛋白A在結(jié)直腸腺癌中的特異性表達(dá)［J］.中國腫瘤臨床，2010，37(23):1342-1343.

［4］史建偉，于躍明，王士杰，等.細(xì)絲蛋白A抑制人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞體外侵襲轉(zhuǎn)移能力［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2011，31(9):1000-1005.

［5］史建偉，于躍明，王士杰，等.細(xì)絲蛋白A抑制荷人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480 裸鼠移植瘤的生長［J］.腫瘤，2011，31(8):701-706.

［6］Fiori JL，Zhu TN，O'Connell MP，et al.Filamin A modulates kinase activation and intracellular trafficking of epidermal growth factor receptors in human melanoma cells［J］.Endocrinology，2009，150(6):2551-2560.

［7］Zhu TN，He HJ，Kole S，et al.Filamin A-mediated down-regulation of the exchange factor ras-GRF1 correlates with decreased matrix metalloproteinase-9 expression in human melanoma cells［J］.J Biol Chem，2007，282(20):14816-14826.

［8］Feng Y，Walsh CA.The many faces of filamin:a versatile molecular scaffold for cell motility and signalling［J］.Nat Cell Biol，2004，6(11):1034-1038.