李紅霞，劉伯鋒，姚珍薇，邵 勇

(1延安大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西延安716000;2延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院;3重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

妊娠肝內(nèi)膽汁淤積癥(ICP)是妊娠期特有的疾病，可導(dǎo)致早產(chǎn)、胎兒窘迫及突然胎死宮內(nèi)，使圍產(chǎn)兒及新生兒病死率增高，但I(xiàn)CP發(fā)病機(jī)制至今仍未完全明了。血紅素氧化酶(HO)是進(jìn)化上高度保守的一族微粒體酶，在調(diào)節(jié)機(jī)體鐵離子穩(wěn)定、抗氧化防御機(jī)制中有重要作用。HO有三種同工酶，HO-1為誘導(dǎo)型，其與妊娠期高血壓疾病和胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩的關(guān)系屢有報(bào)道［1，2］，但 HO-1與 ICP 關(guān)系的研究報(bào)道較少。2010年6月～2011年12月，我們采用免疫組織化學(xué)及圖像分析的方法檢測(cè)了HO-1在不同程度ICP胎盤(pán)組織中的表達(dá)，旨在為進(jìn)一步探討ICP的病因及臨床防治提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 60例ICP患者(ICP組)，年齡(27.53±2.43)歲。均為初產(chǎn)婦，單胎，胎次(2.59±1.29)次，孕周(37.24±1.48)周。均符合《中華婦產(chǎn)科學(xué)》［3］ICP診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中臨床分度為輕度(膽酸20～50 μmol/L，ALT 50～100 U，AST 50～100 U，3 項(xiàng)指標(biāo)只要有兩項(xiàng)達(dá)到即符合標(biāo)準(zhǔn))、中度(膽酸50～100 μmol/L，ALT 101～150 U，AST 101～150 U，3項(xiàng)指標(biāo)只要有兩項(xiàng)達(dá)到即符合標(biāo)準(zhǔn))、重度(膽酸＞100 μmol/L，ALT＞150 U，AST＞150 U，3項(xiàng)指標(biāo)只要有兩項(xiàng)達(dá)到即符合標(biāo)準(zhǔn))各20例。另選擇30例晚期妊娠住院正常孕婦為對(duì)照組，年齡(26.23±2.01)歲，胎次(2.51±1.26)次，孕周(38.52±0.53)周。無(wú)妊娠期高血壓疾病、慢性高血壓、糖尿病及其他心血管等內(nèi)科疾病，無(wú)皮膚瘙癢及黃疸，肝腎功能正常。

1.2 HO-1檢測(cè)方法 胎盤(pán)娩出后迅速避開(kāi)鈣化點(diǎn)，取母體面中央?yún)^(qū)約1.0cm×1.0cm組織，置于4%多聚甲醛中固定、石蠟包埋。使用SP免疫組化法檢測(cè)HO-1表達(dá)。一抗使用多克隆兔抗人血紅素氧合酶-1(HO-1)抗體(Sigma公司)，稀釋度為1∶100，二抗采用生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶100)(武漢博士德公司)。3，3-二氨基苯聯(lián)胺染色，鏡下檢查細(xì)胞質(zhì)或胞膜呈棕黃色或黃色顆粒為陽(yáng)性。用圖像分析儀對(duì)HO-1表達(dá)進(jìn)行定量分析，以平均光密度(OD)值表示著色強(qiáng)度。OD值越大表示抗原含量越高。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SAS8.2統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用±s表示，兩兩比較用q檢驗(yàn)，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

HO-1表達(dá)于胞質(zhì)或胞膜，對(duì)照組整個(gè)絨毛實(shí)質(zhì)均有著色，且為明顯棕黃色(見(jiàn)圖1)。重度ICP者僅部分滋養(yǎng)細(xì)胞著色，絨毛基質(zhì)內(nèi)的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞著色少或無(wú)(見(jiàn)圖2)，中度ICP者少數(shù)絨毛部分著色(見(jiàn)圖3)，而輕度ICP者整個(gè)絨毛實(shí)質(zhì)幾乎均有著色，且為明顯棕黃色(見(jiàn)圖4)。對(duì)照組胎盤(pán)組織中HO-1表達(dá)的OD值為1.512 6±0.102 4，輕、中、重度ICP胎盤(pán)組織中HO-1表達(dá)的OD值分別為1.253 6±0.112 5、1.130 7±0.106 4、0.721 8±0.105 9，對(duì)照組與輕度 ICP者比較，P＜0.05，與中度ICP者比較，P＜0.01，輕、中度ICP與重度比較，P 均 ＜0.05。

圖1 HO-1在正常胎盤(pán)組織中強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(SABC×400)

圖2 HO-1在重度ICP妊娠胎盤(pán)組織中弱陽(yáng)性表達(dá)(SABC×400)

圖3 HO-1在中度ICP妊娠胎盤(pán)組織中陽(yáng)性表達(dá)(SABC×400)

圖4 HO-1在輕度ICP胎盤(pán)組織中陽(yáng)性表達(dá)(SABC×400)

3 討論

ICP是妊娠期特有的并發(fā)癥，目前病因不明。有學(xué)者對(duì) ICP 胎盤(pán)的形態(tài)學(xué)［4］、組織計(jì)量學(xué)［5］、血流動(dòng)力學(xué)［6］及胎盤(pán)膜對(duì)氧的擴(kuò)散能力［7］等進(jìn)行研究，結(jié)果提示ICP胎盤(pán)改變可能僅引起胎盤(pán)氧儲(chǔ)備力下降，胎盤(pán)自身因素可能并非ICP胎兒缺氧及死亡的確切原因。

近年研究提示HO-1具有抗炎、抗凋亡、抗增生效應(yīng)，并且在相關(guān)病癥如動(dòng)脈硬化、腦缺血、器官移植排斥反應(yīng)中具有細(xì)胞保護(hù)作用。因此，HO-1的生物學(xué)活性及其在臨床眾多疾病中的保護(hù)作用已受到諸多學(xué)者的關(guān)注。HO的抗氧化作用有最佳表達(dá)閾值［8］，HO適量表達(dá)，可以減少細(xì)胞死亡、蛋白質(zhì)氧化及脂質(zhì)過(guò)氧化，促進(jìn)細(xì)胞增殖;表達(dá)量過(guò)高，則可能破壞細(xì)胞的完整性;表達(dá)降低，保護(hù)作用下降，細(xì)胞易受各種有害因素的侵襲。Makino等［9］認(rèn)為HO-1降低血管張力的作用主要通過(guò)內(nèi)源性一氧化碳(CO)的作用而實(shí)現(xiàn)。CO可以調(diào)節(jié)子宮胎盤(pán)血流動(dòng)力學(xué)，參與滋養(yǎng)細(xì)胞分化與浸潤(rùn)、胎盤(pán)血管的功能調(diào)控，使循環(huán)血管保持一定程度的松弛，以適應(yīng)妊娠的需要，保證子宮胎盤(pán)的血流灌注［10～12］。據(jù)報(bào)道，HO表達(dá)增多能增加胎盤(pán)血管和舒張，且與CO的生成量呈正相關(guān)［10］。國(guó)外學(xué)者研究表明，正常妊娠時(shí)大鼠和人類胎盤(pán)均有大量HO-1表達(dá)，且妊娠大鼠HO-1水平顯著高于其非孕時(shí)肝和脾中的HO水平［11］。隨妊娠進(jìn)展需要較多的CO維持胎兒的發(fā)育。HO是血紅素降解生成CO的限速酶，隨妊娠進(jìn)展HO需要量亦增加。HO-1蛋白主要定位于胎盤(pán)合體滋養(yǎng)細(xì)胞及絨毛間質(zhì)細(xì)胞，胎盤(pán)干絨毛動(dòng)脈血管周?chē)|(zhì)亦有陽(yáng)性表達(dá)［12］。本研究結(jié)果與此一致。HO-1的作用可能有利于滋養(yǎng)細(xì)胞從母血中攝取更多營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、調(diào)節(jié)絨毛血管的發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn)，將人類HO-1基因轉(zhuǎn)染至冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，能加速細(xì)胞的生長(zhǎng)和血管生成［10］。對(duì)妊娠的大鼠轉(zhuǎn)染HO-1基因后，鼠仔的體質(zhì)量明顯增加，且轉(zhuǎn)染組胎盤(pán)組織中VEGF、IGF-1及其受體表達(dá)相應(yīng)增加，提示HO-1及其催化產(chǎn)物不僅能直接增加胎兒胎盤(pán)循環(huán)血流，還能通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，加強(qiáng)胎盤(pán)生長(zhǎng)因子的表達(dá)和激活，進(jìn)一步改善胎盤(pán)循環(huán)和胎兒生長(zhǎng)發(fā)育［2］。若HO的表達(dá)不足，可能與病理妊娠有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HO-1在不同程度ICP患者胎盤(pán)組織中均有表達(dá)，并且隨著ICP患者病情加重表達(dá)減弱。經(jīng)圖像分析重度ICP者HO-1表達(dá)水平比輕度和中度者明顯下降。HO-1在ICP胎盤(pán)組織中表達(dá)下調(diào)，此可能是ICP的發(fā)病原因之一。Ahmed等［13］亦有類似的結(jié)果。提示妊娠期胎盤(pán)部位表達(dá)的HO-1可能作為內(nèi)源性保護(hù)系統(tǒng)，保護(hù)胎盤(pán)組織免受氧化損傷及調(diào)控胎盤(pán)血管舒張，對(duì)正常妊娠維持起重要作用。故推測(cè)HO-1表達(dá)的異常是造成ICP及胎兒不良預(yù)后的原因之一，并且與疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)。臨床監(jiān)測(cè)HO-1對(duì)于確定疾病分度、療效觀察及胎兒預(yù)后均有積極意義。

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