孫悅文 梁 鋼 唐燕霞

廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西南寧 530021

腫瘤的發(fā)生需要微小血管的增生與灌流提供營養(yǎng)，異常的血管生成是腫瘤的一個明顯特征，因此，如何抑制腫瘤血管生長已經(jīng)成為抗腫瘤藥物研究的一個非常重要的方向[1]。目前已發(fā)現(xiàn)有多種中藥可通過增強(qiáng)VEGF的表達(dá)促進(jìn)血管的生成[2]，同時也利用CAM模型發(fā)現(xiàn)了多種中草藥的抑制血管生成作用[3]。索拉菲尼可以通過上游抑制酪氨酸激酶受體VEGFR和PDGFR而達(dá)到抑制血管生成的作用[4]，破骨風(fēng)性平，可祛風(fēng)除濕，活血散瘀，消腫止痛[5]；天胡荽性涼，有小毒，利濕止咳，涼血止血[6]；土半夏性溫，味辛，有毒，燥濕化痰，和胃健脾，有抗凝血作用[7]；血黨性平，無毒，有活血調(diào)經(jīng)，補(bǔ)血止血，利咽消腫的功效[8]。以上藥物均具有血液血管相關(guān)的功效，為分析其作用，本文以索拉菲尼為陽性藥，采用雞胚絨毛尿囊模型觀察藥物對血管生長作用的影響，探討藥物對血管生成的作用，研究藥物可能存在的酪氨酸蛋白激酶抑制作用的靶向性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 雞胚 共144枚，購自南寧市良鳳農(nóng)牧有限責(zé)任公司。

1.1.2 藥物 破骨風(fēng)、土半夏、血黨、天胡荽購自廣西桂林市騰龍?zhí)盟帢I(yè)有限責(zé)任公司同心園藥店；上述中藥均經(jīng)過廣西中藥研究所鑒定并確認(rèn)。索拉菲尼購自拜耳公司，片劑，200 mg/片，批準(zhǔn)文號 H20060296。

1.1.3 儀器與試劑 CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），倒置相差顯微鏡（日本OLYMPUS公司），Hfsafe 1200安全柜（香港熱力發(fā)展有限公司），LDZX-50FBS立式高壓滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠），乙醇（購自成都市科龍化工試劑廠）。

1.2 方法

1.2.1 藥材的提取

1.2.1.1 藥材的選擇、提取與萃取 醇提：將藥材泡在約5倍體積75%的乙醇溶液中，回流提取2 h，得到濾液；重復(fù)1次；合并兩次藥液，過濾，濃縮至浸膏，移入干凈的瓶中備用。

1.2.1.2 藥物的濃度配置 雞胚實驗：索拉菲尼配成25 mg/mL[9]，各藥物配成50 mg/mL，對半稀釋2次得到3個濃度，得到索拉菲尼濃度：25 mg/mL，12.5 mg/mL，6.25 mg/mL；四種中藥濃度：50 mg/mL，25 mg/mL，12.5 mg/mL。各藥物在安全柜中0.22 μm微孔濾膜過濾，保存于-4℃。

1.2.2 假氣室的制備及加藥

取7日齡雞胚隨機(jī)分為給藥組和空白組，每組9枚。75%酒精棉球擦洗兩遍消毒，雞蛋氣室向上，長托與蛋托呈 45℃，放入溫度（37.0±0.5）℃，相對濕度 60%的 CO2培養(yǎng)箱中孵育。第2天，于超凈工作臺在氣室上方蛋殼處敲破蛋殼，用眼科鑷開1.5 cm×1.5 cm窗口，暴露下方的卵殼內(nèi)膜，將預(yù)先剪成直徑5mm的滅菌定性濾紙[10]圓片放在CAM上較少血管處，實驗組加入100 μL不同濃度藥物，空白對照組加入100 μL氯化鈉注射液。然后用滅菌的透明膠紙封閉卵殼開口，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中孵育[11]。

1.2.3 CAM標(biāo)本的制作

加藥孵育 48 h 后，加入甲醇∶丙酮（1∶1）的固定液 1.5 mL，室溫下固定15 min，待CAM的血管完全凝固后，用眼科鑷去掉CAM平面以上的卵殼和卵殼膜，并用眼科剪以濾紙載體為中心，完整剪下CAM，置盛有蒸餾水的碟皿中，用眼科鑷舒展CAM，將其平鋪于載玻片上。陰干。在顯微鏡下（×40）觀察血管生長情況。血管計數(shù)記錄以載體為中心，半徑5 mm內(nèi)的血管數(shù)。用倒置顯微鏡觀察出大、中、小血管的粗細(xì)，計數(shù)。根據(jù)血管直徑將血管分為三類：（1）＞0.2 mm為一級血管；②＞0.05 mm且＜0.2 mm為二級血管；（3）＜0.05 mm為三級血管。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計量資料以（x±s）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

與空白對照組相比，索拉菲尼組、破骨風(fēng)組均能使雞胚的二、三級血管減少（P＜0.01），土半夏組，血黨組能抑制雞胚三級血管的生長（P＜0.01），并且其高劑量組也能夠抑制二級血管的生長（P＜0.01）。其中，索拉菲尼組對二三級血管的抑制呈現(xiàn)劑量依賴性 （高低劑量對比，P＜0.01），破骨風(fēng)組對三級血管的抑制呈現(xiàn)劑量依賴性（高低劑量對比，P＜0.01），高劑量組對二級血管的抑制率與中低劑量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；血黨組與土半夏組對三級血管的抑制也呈現(xiàn)劑量依賴性（P＜0.01）；天胡荽雖高劑量對三級血管生長有一定抑制作用但是抑制作用較弱。具體見表1。各藥物組對大血管的生長均有影響，因大血管數(shù)量少故不做統(tǒng)計學(xué)分析。

3 討論

血管生成是指從母血管發(fā)芽生成出新的微小血管，在實體瘤的生長和轉(zhuǎn)移過程中，微血管起著至關(guān)重要的作用[12]。因此，通過抑制腫瘤組織的新血管形成可以抑制腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移。

在研究血管生成領(lǐng)域，CAM是一個比較成熟經(jīng)典的模型。雞胚在孵育的第3~5天和第7~10天血管生長最為活躍，第12天以后血管漸漸開始萎縮，因此，8天~12天是藥物作用的最好時期[13]。

在本實驗中可以看到，各藥物組對一級血管的生長也有一定影響，各藥物均能減少一級血管的均數(shù)，其中以土半夏與破骨風(fēng)作用最強(qiáng)。提示藥物對雞胚主血管的發(fā)生也有一定影響。

表1 不同藥物組對雞胚CAM血管生成的影響（x±s）

在本實驗中可以看到索拉菲尼與破骨風(fēng)對血管有明顯的抑制作用，同時，土半夏組與血黨組亦表現(xiàn)出一定的抑制作用，提示其中可能含有能抑制血管生長的成分，并有可能通過與索拉菲尼同樣的信號傳導(dǎo)途徑實現(xiàn)這一抑制作用。

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